鶏胚における単一細胞のトランスフェクション
Summary
ファインチップを使用すると、我々はニワトリの体節や神経管のサブドメインにプラスミドDNAを注入するマイクロピペット。プラスミドの濃度は、単一のトランスフェクションされた細胞を生成するために調整されます。私たちは、その後、細胞はクローン集団に発展することができます。
Abstract
発生生物学の中心テーマは、系統の多様化と分子メカニズムの解明である。これは正常な実験条件下で単一細胞の運命の徹底的な分析を伴います。この目的のために、単一の前駆細胞を標的とトランスフェクション法が前提です。私たちはトレーシング信頼性の高い系統と同様に遺伝子操作を可能にする、ここに、OVOでの鶏の組織で単一の細胞をトランスフェクトするための技術的に簡単な方法を説明します。特定の組織のドメインは、体節や神経管の中でターゲットとしている、とするDNAを単一の細胞の散発的なトランスフェクションの結果、関心の上皮に直接注入される。記者を使って、クローン集団は結果的に3日間まで遡ることができる、そして遺伝子操作クローン集団の挙動は、対照のそれと比較することができます。このメソッドは、遺伝子操作のための新たなツールと共に、ニワトリ胚のアクセシビリティを活用しています。我々は、比較とその広く使用されているエレクトロポレーション法上の利点、および可能なアプリケーションについて説明し、また提案されている追加のin vivoモデルで使用してください。我々は既存の系統のトレースと遺伝的干渉のツールのための重要な追加機能と補完するものとしてこのメソッドの使用を提唱。
Protocol
Discussion
上記の方法では、小細胞サブセットまたは単一の前駆細胞を3に親油性色素を提供するための前述した手法を変更したものです。それは標準的なエレクトロポレーション法に比べて3つの主な利点があります。最初に、それは（C、例えば図1Bを参照されたい）、エレクトロポレーションよりはるかに大きい空間分解能を可能にする、標的組織への信頼離散サイトで標識するための手段を…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、神経管の画像にShlomi Krispinに感謝。特に、我々はGFPのトランスフェクション技術を開始するためのYuvalシナモンを認めます。この作品は、イスラエル科学財団、協会フランセーズcontre LESミオパシー、およびDeutche Forschungsgemeinshaft、共同研究センター488からCKへの補助金によって支えられて
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Pipette tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | ||
| Capillaries | Drummond Scientific | 2-000-100 | ||
| Insect needles | Watkins & Doncaster | E6871 | ||
| Pen-Strep solution | Biological Industries | 03-031-1B |
References
- Ben-Yair, R., Kalcheim, C. Lineage analysis of the avian dermomyotome sheet reveals the existence of single cells with both dermal and muscle progenitor fates. Development. 132, 689-701 (2005).
- Ben-Yair, R., Kalcheim, C. Notch and bone morphogenetic protein differentially act on dermomyotome cells to generate endothelium, smooth, and striated muscle. J Cell Biol. 180, 607-618 (2008).
- Cinnamon, Y., Kahane, N., Kalcheim, C. Characterization of the early development of specific hypaxial muscles from the ventrolateral myotome. . Development. 126, 4305-4315 (1999).
- Stark, D. A., Kulesa, P. M. Photoactivatable green fluorescent protein as a single-cell marker in living embryos. Dev Dyn. 233, 983-992 (2005).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo–from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J Vis Exp. , (2008).
- Nagai, T. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Sato, Y. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Dev Biol. 305, 616-624 (2007).
