الكروماتوجراف الدهون تقارب الحويصلة بوساطة الفرز المغناطيسي باستخدام خلية المنشط (LIMACS) : طريقة جديدة لتحليل البروتين الدهني التفاعل
Summary
لاختبار مدى تفاعل البروتين الدهني مع هدفها كنا MACS وAnnexin V – مترافق الخرز المغناطيسي وحويصلات الدهنية من الدهون المركبة المستهدفة وAnnexin فسفاتيديل V – ملزمة. هي بروتينات الدهنية منضم إلى الهدف المشترك تنقيتها وتحليلها بعد شطف من الخرز.
Abstract
تحليل التفاعل البروتين الدهني صعب جدا ، لأن جزءا لا يتجزأ من الدهون في أغشية الخلايا ، وبالتالي ، لا يمكن الوصول إليها إلى إجراءات أشد تنقية. كبديل ، يمكن أن تكون مغلفة الدهون على الأسطح المسطحة كما تستخدم لمأكل مثل الطحين والدهن ELISA الطيفي بالرنين. ومع ذلك ، والدهون طلاء السطح لا تشكل هياكل microdomain ، والتي قد تكون مهمة لخصائص الربط الدهون. مزيد من هذه الطرق لا تسمح لتنقية كميات أكبر من البروتينات ملزمة الدهون المستهدفة.
للتغلب على هذه القيود المفروضة على اختبار البروتين الدهني التفاعل وتنقية البروتينات الشحمية ملزمة طورنا طريقة جديدة تسمى اللوني الدهون تقارب حويصلة بوساطة استخدام الفرز المغناطيسي تنشيط الخلية (LIMACS). في هذه الطريقة ، يتم إعداد حويصلات الدهن مع وجود الهدف والدهون مثل الدهون فسفاتيديل مرساة لMACS Annexin الخامس. فسفاتيديل هو غشاء الخلية التي تظهر في كل مكان فسفوليبيد تقارب عالية لبروتين خامسا Annexin باستخدام الخرز المغناطيسي مترافق إلى الخامس Annexin الحويصلات التي تحتوي على الدهون فسفاتيديل سوف ربط الخرز المغناطيسي. متى يتم تحضين الحويصلات الدهون مع خلية lysate أيضا البروتين الدهني ملزما للهدف أن تكون ملزمة للالخرز ويمكن أن يشترك في تنقية MACS به. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لمعرفة ما إذا البروتينات المؤتلف إعادة مجمع البروتين الدهني ملزما للهدف.
وقد استخدمنا هذا الأسلوب لإظهار التفاعل بين PKC شاذة (aPKC) مع سيراميد الشحميات السفينغولية وشارك في تنقية استجابة الخلايا البروستاتا 4 (PAR – 4) ، وهو بروتين ملزمة لسيراميد المرتبطة aPKC. وقد استخدمنا هذا الأسلوب أيضا لإعادة هيكلة مجمع سيراميد المرتبطة من aPKC المؤتلف مع الخلية القطبية ذات الصلة والبروتينات Par6 Cdc42. حيث يمكن إعداد حويصلات الدهنية مع مجموعة متنوعة من الدهون الفوسفاتية أو sphingo ، LIMACS يقدم تنوعا لاختبار البروتين الدهني التفاعل في بيئة الدهون التي تمثل بشكل وثيق من أن غشاء الخلية. يمكن التعرف على البروتين الدهني إضافية المجمعات باستخدام تحليل البروتينات من البروتين الدهني الملزم الذي اشترك في المنقى مع حويصلات الدهنية.
Protocol
Discussion
لاختبار مدى التفاعل بين محددة الدهون والبروتين ملزمة تعوقها تضمين الدهون في غشاء الخلية. غشاء الخلية يتكون من خليط من عدة الدهون والبروتينات ويتم تنظيمه في microdomains الدهون أو الطوافات. لذلك ، يمكن المشارك تنقية microdomains والبروتينات لا يميز بوضوح ما إذا كان بروتين يرتبط …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة وR01NS046835 R01AG034389 ، ومارس من منحة الدايمات 6FY08 – 322. شكر خاص مكرس لك السيدة اليانور براون (Miltenyi بيوتيك ، صحراء ، كاليفورنيا) الذي ساعد بشكل كبير على بصيرة لها في MACS التكنولوجيا. وقد قدمت بسخاء Miltenyi المواد المستخدمة للمظاهرة من التجارب في أي تكلفة. كما أنني ممتن للدكتور جوانجهو وانغ (كلية الطب في جورجيا / جامعة جورجيا العلوم الصحية ، أوغوستا ، GA) الذي ولدت PKCζ معربا عن خطوط الخلايا. ومن المسلم به أيضا دعم من قبل معهد الطب الجزيئي في كلية الطب في جورجيا / جامعة جورجيا للعلوم الصحية (في إطار الاتجاه من الدكتور لين مى).
Materials
Annexin V-conjugated magnetic beads and MACS micro and minicolumns were provided by Miltenyi Biotec, Inc. (Auburn, CA). All lipids were of highest purity and obtained from Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL).
References
- Wang, G. Direct binding to ceramide activates protein kinase Czeta before the formation of a pro-apoptotic complex with PAR-4 in differentiating stem cells. J Biol Chem. 280, 26415-26424 (2005).
- Wang, G., Krishnamurthy, K., Umapathy, N. S., Verin, A. D., Bieberich, E. The carboxyl-terminal domain of atypical protein kinase Czeta binds to ceramide and regulates junction formation in epithelial cells. J Biol Chem. 284, 14469-14475 (2008).
- Chalfant, C. E. De novo ceramide regulates the alternative splicing of caspase 9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells. Dependence on protein phosphatase-1. J Biol Chem. 277, 12587-12595 (2002).
- Simon, C. G., Holloway, P. W., Gear, A. R. Exchange of C(16)-ceramide between phospholipid vesicles. Biochemistry. 38, 14676-14682 (1999).
- Goni, F. M., Contreras, F. X., Montes, L. R., Sot, J., Alonso, A. Biophysics (and sociology) of ceramides. Biochem Soc Symp. , 177-188 (2005).
- Kumagai, K. CERT mediates intermembrane transfer of various molecular species of ceramides. J Biol Chem. 280, 6488-6495 (2005).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal Biochem. 138, 141-143 (1984).
