Cromatografia de afinidade lipídica mediada por vesículas com separação de células Magnetic Ativado (LIMACS): um novo método para analisar proteínas lipídios Interação
Summary
Para testar a interação de uma proteína com o seu alvo de lipídios foi utilizado MACS e anexina V conjugada esferas magnéticas e vesículas de lipídios sintetizados a partir de lipídios alvo e fosfatidilserina anexina V vinculativo. Proteínas vinculado à lipídica alvo são co-purificados e analisados após eluição dos grânulos.
Abstract
A análise de interação proteína lipídica é difícil porque os lipídios são incorporados nas membranas celulares e, portanto, inacessíveis para a maioria dos procedimentos de purificação. Como alternativa, os lipídios podem ser revestidos em superfícies planas como as usadas em lipídios ELISA e ressonância Plasmon espectroscopia. No entanto, lipídios revestimento de superfície não formam estruturas microdomínio, que pode ser importante para as propriedades de lipídios vinculativo. Além disso, estes métodos não permitem a purificação de grandes quantidades de proteínas de ligação a lipídeos seu alvo.
Para superar essas limitações dos testes de interação de proteínas lipídios e purificar proteínas de ligação de lipídios foi desenvolvido um novo método denominado de lipídios cromatografia de afinidade vesícula mediada magnética usando-activated cell sorting (LIMACS). Neste método, vesículas lipídicas são preparados com os lipídios alvo e fosfatidilserina como os lipídios âncora para anexina V MACS. Fosfatidilserina é um fosfolipídio de membrana onipresente celular que mostra alta afinidade à proteína anexina V. Usando esferas magnéticas conjugadas a anexina V vesículas lipídicas contendo fosfatidilserina-se ligará à esferas magnéticas. Quando as vesículas lipídicas são incubadas com uma célula lisado a proteína de ligação ao lipídios alvo também será obrigado a as contas e pode ser co-purificado utilizando MACS. Este método também pode ser usado para testar se proteínas recombinantes reconstituir um complexo de proteínas de ligação ao lipídios alvo.
Temos utilizado este método para mostrar a interação da PKC atípica (aPKC) com a ceramida sphingolipid e co-purificar resposta a apoptose de próstata 4 (PAR-4), uma proteína de ligação a ceramida associada aPKC. Temos também utilizado este método para a reconstituição de um complexo de ceramidas associados da aPKC recombinante com a célula de polaridade proteínas relacionadas Par6 e Cdc42. Desde vesículas lipídicas pode ser preparado com uma variedade de esfingo ou fosfolipídios, LIMACS oferece um teste versátil para lipídios proteínas de interação em um ambiente de lipídios que se assemelha de perto o da membrana celular. Complexos de proteína adicional de lipídios pode ser identificado através da análise proteômica de proteínas lipídios vinculativo co-purificada com as vesículas lipídicas.
Protocol
Discussion
Para testar a interação específica entre um lipídio e sua proteína de ligação é prejudicada pela incorporação de lipídios na membrana da célula. A membrana celular consiste de uma mistura de lipídios e proteínas diversas e é organizado em microdomínios lipídicos ou jangadas. Portanto, o co-purificação de proteínas microdomínios e não pode distinguir claramente se uma proteína diretamente liga-se a um lipídio ou só é enriquecido em uma estrutura microdomínio. Outros métodos usando lipídios de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01NS046835 e R01AG034389, ea March of Dimes conceder 6FY08-322. Um agradecimento especial é dedicado a Sra. Eleanor Brown (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), que ajudou tremendamente com a sua visão sobre a tecnologia MACS. Miltenyi generosamente forneceu o material utilizado para a demonstração dos experimentos, sem nenhum custo. Agradeço também ao Dr. Guanghu Wang (Medical College of Geórgia / Georgia Health Sciences University, Augusta, GA), que gerou o PKCζ expressar linhas celulares. Apoio por parte do Instituto de Medicina Molecular da Faculdade de Medicina da Geórgia / Georgia Health Sciences University (sob direção do Dr. Lin Mei) também é reconhecido.
Materials
Annexin V-conjugated magnetic beads and MACS micro and minicolumns were provided by Miltenyi Biotec, Inc. (Auburn, CA). All lipids were of highest purity and obtained from Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL).
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