שלפוחיות בתיווך זיקה ליפידים כרומטוגרפיה באמצעות Cell מגנטי מיון פעיל (LIMACS): שיטה חדשה לנתח חלבון, שומנים אינטראקציה
Summary
כדי לבדוק את האינטראקציה של חלבון עם שומנים היעד השתמשנו macs ו Annexin V-מצומדות חרוזים מגנטיים שלפוחית השומנים מסונתז מ השומנים היעד Annexin V-מחייב phosphatidylserine. חלבונים חייב השומנים היעד הם שיתוף מטוהרים ונותחו לאחר elution מן החרוזים.
Abstract
ניתוח של אינטראקציה חלבון שומנים קשה בגלל שומנים המוטבעים קרום התא ולכן נגיש הליכי טיהור ביותר. כחלופה, שומנים יכולים להיות מצופים על משטחים שטוחים כמו משמש השומנים ELISA ו Plasmon ספקטרוסקופיית תהודה. עם זאת, ציפוי משטח שומנים לא יוצרים מבנים microdomain, אשר עשוי להיות חשוב עבור המאפיינים מחייב השומנים. יתר על כן, שיטות אלו אינן מאפשרות לטיהור של כמויות גדולות יותר של חלבונים מחייב שומנים היעד שלהם.
כדי להתגבר על המגבלות האלה של בדיקת חלבון אינטראקציה שומנים לטהר חלבונים מחייב השומנים פיתחנו שיטה חדשה המכונה שלפוחית בתיווך זיקה השומנים באמצעות כרומטוגרפיה המגנטי המופעל מיון תאים (LIMACS). בשיטה זו, שלפוחית השומנים מוכנים עם השומנים היעד phosphatidylserine כמו שומנים עוגן עבור Annexin V MACS. Phosphatidylserine הוא נמצא בכל מקום קרום התא פוספוליפידים המציגה בזיקה גבוהה Annexin החלבון V. שימוש חרוזים מגנטיים מצומדות כדי Annexin V phosphatidylserine המכילים שומנים שלפוחית יהיה לאגד את חרוזים מגנטיים. כאשר שלפוחית השומנים מודגרת עם תא lysate חלבון מחייב השומנים היעד יהיה גם חייב את החרוזים יכול להיות שותף מטוהרים באמצעות MACS. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לבדוק אם חלבונים רקומביננטי מחדש מורכב חלבון מחייב השומנים היעד.
השתמשנו בשיטה זו כדי להראות את האינטראקציה של PKC טיפוסיות (aPKC) עם ceramide sphingolipid ואת התגובה הערמונית שיתוף לטהר אפופטוזיס 4 (PAR-4), חלבון מחייב aPKC ceramide הקשורים. יש לנו גם השתמשו בשיטה זו בריאורגניזציה של מורכבות ceramide הקשורים של aPKC רקומביננטי עם הקוטביות בתא חלבונים הקשורים Par6 ו Cdc42. מאז שלפוחית השומנים ניתן להכין עם מגוון רחב של sphingo או פוספוליפידים, LIMACS מציע מבחן תכליתי עבור אינטראקציה שומנים החלבון בסביבה השומנים הדומה באופן הדוק לזה של קרום התא. חלבון נוסף מתחמי השומנים ניתן לזהות באמצעות ניתוח proteomics של חלבון שומנים מחייב שיתוף מטוהרים עם שלפוחית השומנים.
Protocol
Discussion
כדי לבחון את האינטראקציה בין השומנים ספציפי לבין חלבון מחייב שלה הקשו על ידי הטבעה של שומנים בקרום התא. קרום התא מורכב מתערובת של שומנים וחלבונים כמה זה מאורגן microdomains שומנים או רפסודות. לכן, שיתוף טיהור microdomains וחלבונים לא יכול להבחין בבירור אם החלבון נקשר ישירות שומנ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH R01NS046835 ו R01AG034389, ואת מצעד הפרוטות מענק 6FY08-322. תודה מיוחדת מוקדשת גב 'אלינור בראון (Miltenyi BIOTEC, אובורן, CA) שעזר מאוד עם תובנה אותה טכנולוגיה MACS. Miltenyi סיפקה בנדיבות את החומר המשמש הפגנה של הניסויים ללא עלות. אני אסירת תודה גם לד"ר Guanghu וואנג (Medical College של גאורגיה / גאורגיה למדעי הבריאות באוניברסיטה, אוגוסטה, GA) מי שהפיק את PKCζ להביע שורות תאים. תמיכה על ידי המכון לרפואה מולקולרית בבית הספר לרפואה של גרוזיה / גאורגיה למדעי הבריאות באוניברסיטה (בניהולו של ד"ר לין מי) הוא גם הודה.
Materials
Annexin V-conjugated magnetic beads and MACS micro and minicolumns were provided by Miltenyi Biotec, Inc. (Auburn, CA). All lipids were of highest purity and obtained from Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL).
References
- Wang, G. Direct binding to ceramide activates protein kinase Czeta before the formation of a pro-apoptotic complex with PAR-4 in differentiating stem cells. J Biol Chem. 280, 26415-26424 (2005).
- Wang, G., Krishnamurthy, K., Umapathy, N. S., Verin, A. D., Bieberich, E. The carboxyl-terminal domain of atypical protein kinase Czeta binds to ceramide and regulates junction formation in epithelial cells. J Biol Chem. 284, 14469-14475 (2008).
- Chalfant, C. E. De novo ceramide regulates the alternative splicing of caspase 9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells. Dependence on protein phosphatase-1. J Biol Chem. 277, 12587-12595 (2002).
- Simon, C. G., Holloway, P. W., Gear, A. R. Exchange of C(16)-ceramide between phospholipid vesicles. Biochemistry. 38, 14676-14682 (1999).
- Goni, F. M., Contreras, F. X., Montes, L. R., Sot, J., Alonso, A. Biophysics (and sociology) of ceramides. Biochem Soc Symp. , 177-188 (2005).
- Kumagai, K. CERT mediates intermembrane transfer of various molecular species of ceramides. J Biol Chem. 280, 6488-6495 (2005).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal Biochem. 138, 141-143 (1984).
