Lipide bolletjes-gemedieerde affiniteitschromatografie met behulp van Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): een nieuwe methode om eiwit-lipide Interactie Analyze
Summary
Om de interactie van een proteïne test met haar doel lipide gebruikten we MACS en Annexine V-geconjugeerde magnetische kralen en lipide vesicles gesynthetiseerd uit het doel lipiden en Annexine V-bindend fosfatidylserine. Eiwitten gebonden aan de doelgroep lipide zijn co-gezuiverd en geanalyseerd na elutie van de kralen.
Abstract
De analyse van lipide-eiwit interacties is moeilijk omdat lipiden zijn ingebed in celmembranen en daarom ontoegankelijk voor de meeste zuivering procedures. Als alternatief kunnen lipiden worden gecoat op vlakke oppervlakken zoals gebruikt voor het lipide ELISA en Plasmon resonantie spectroscopie. Echter, coating lipiden vormen geen microdomain structuren, die belangrijk kan zijn voor de lipide bindende eigenschappen. Verder zijn deze methoden niet toe dat voor de zuivering van grotere hoeveelheden eiwitten te binden aan hun doel lipiden.
Om deze beperkingen van het testen van lipide-eiwit interacties en het lipide-bindende eiwitten te zuiveren ontwikkelden we een nieuwe methode genoemd lipide bolletjes-gemedieerde affiniteitschromatografie met behulp van magnetische-geactiveerde cel sortering (LIMACS). Bij deze methode zijn lipide blaasjes bereid met het doel lipiden en fosfatidylserine als anker voor de lipide Annexine V MACS. Fosfatidylserine is een alomtegenwoordige celmembraan fosfolipide dat een hoge affiniteit voor het eiwit annexine V. Met behulp van magnetische korrels geconjugeerd aan Annexine V de fosfatidylserine-bevattende lipide vesicles zal binden aan de magnetische korrels laat zien. Als de lipide vesicles worden geïncubeerd met een cellysaat het eiwit binding aan het doel lipide zal ook gebonden aan de kralen en kan mede worden gezuiverd met behulp van MACS. Deze methode kan ook gebruikt worden om te testen of recombinante eiwitten reconstrueren een eiwit complex binding aan het doel lipide.
We hebben gebruik gemaakt van deze methode om de interactie van atypische PKC (aPKC) show met de sfingolipide ceramide en om samen te zuiveren prostaat apoptose respons 4 (PAR-4), een eiwit binding aan ceramide-geassocieerde aPKC. We hebben ook gebruik gemaakt van deze methode voor de reconstructie van een ceramide-geassocieerd complex van recombinant aPKC met de celpolariteit-gerelateerde eiwitten Par6 en Cdc42. Omdat lipide vesicles kunnen worden bereid met een verscheidenheid van sphingo-of fosfolipiden, LIMACS biedt een veelzijdige test voor lipide-eiwit interacties in een lipide omgeving die sterk lijkt op die van de celmembraan. Extra lipide-eiwit-complexen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van proteomics analyse van de lipiden bindend eiwit co-gezuiverd met het lipide blaasjes.
Protocol
Discussion
Voor het testen van de specifieke interactie tussen een lipide en zijn bindend eiwit wordt belemmerd door inbedding van lipiden in het celmembraan. De celmembraan bestaat uit een mengsel van verschillende vetten en eiwitten en het is georganiseerd in lipide microdomeinen of vlotten. Daarom kan de co-zuivering van microdomeinen en eiwitten niet duidelijk onderscheiden of een eiwit direct bindt aan een lipide of slechts verrijkt met een microdomain structuur. Andere methoden met behulp van bepaalde lipiden gecoate op oppe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de NIH beurzen R01NS046835 en R01AG034389, en de March of Dimes subsidie 6FY08-322. Een speciaal woord van dank is gewijd aan mevrouw Eleanor Brown (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), die enorm geholpen met haar inzicht in de MACS techniek. Miltenyi heeft royaal mits het materiaal wordt gebruikt voor de demonstratie van de experimenten zonder kosten. Ik ben ook dankbaar dat dr. Guanghu Wang (Medical College of Georgia / Georgia Health Sciences University, Augusta, GA) die de gegenereerde PKCζ uiten cellijnen. Ondersteuning door het Instituut voor Moleculaire Geneeskunde van het Medical College of Georgia / Georgia Health Sciences University (onder leiding van Dr Lin Mei) is ook erkend.
Materials
Annexin V-conjugated magnetic beads and MACS micro and minicolumns were provided by Miltenyi Biotec, Inc. (Auburn, CA). All lipids were of highest purity and obtained from Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL).
References
- Wang, G. Direct binding to ceramide activates protein kinase Czeta before the formation of a pro-apoptotic complex with PAR-4 in differentiating stem cells. J Biol Chem. 280, 26415-26424 (2005).
- Wang, G., Krishnamurthy, K., Umapathy, N. S., Verin, A. D., Bieberich, E. The carboxyl-terminal domain of atypical protein kinase Czeta binds to ceramide and regulates junction formation in epithelial cells. J Biol Chem. 284, 14469-14475 (2008).
- Chalfant, C. E. De novo ceramide regulates the alternative splicing of caspase 9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells. Dependence on protein phosphatase-1. J Biol Chem. 277, 12587-12595 (2002).
- Simon, C. G., Holloway, P. W., Gear, A. R. Exchange of C(16)-ceramide between phospholipid vesicles. Biochemistry. 38, 14676-14682 (1999).
- Goni, F. M., Contreras, F. X., Montes, L. R., Sot, J., Alonso, A. Biophysics (and sociology) of ceramides. Biochem Soc Symp. , 177-188 (2005).
- Kumagai, K. CERT mediates intermembrane transfer of various molecular species of ceramides. J Biol Chem. 280, 6488-6495 (2005).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal Biochem. 138, 141-143 (1984).
