شاشة عالية الإنتاجية الخميرة Overexpression البلازميد
Summary
نحن هنا وصف شاشة overexpression في البلازميد<em> السكيراء الجعوية</em> ، وذلك باستخدام مكتبة المحتشدة البلازميد والتحول خميرة بروتوكول عالية الإنتاجية مع الروبوت مناولة السائل.
Abstract
الخميرة في مهدها ، السكيراء البيرة ، هو نموذج النظام قوية لتحديد الآليات الأساسية لكثير من العمليات الخلوية الهامة ، بما فيها تلك التي لها صلة مباشرة الأمراض التي تصيب البشر. لأن من وقته قصير والجيل جيدا اتسم الجينوم ، ميزة كبيرة التجريبية لنظام الخميرة النموذج هو القدرة على أداء شاشات الجينية لتحديد الجينات والمسارات التي تشارك في عملية معينة. على مدى السنوات الثلاثين الماضية قد استخدمت مثل هذه الشاشات الجينية لاستجلاء دورة الخلية ، ومسار إفرازية ، والعديد من الجوانب الأكثر حفظا للغاية من بيولوجيا الخلايا حقيقية النواة 1-5. في السنوات القليلة الماضية ، تم إنشاء العديد من المكتبات genomewide سلالات الخميرة والبلازميدات 6-10. هذه المجموعات تسمح الآن للاستجواب المنهجي للحصول على وظائف الجينات باستخدام والخسارة من وظيفة نهج 11-16. هنا نقدم بروتوكول مفصلة لاستخدام بروتوكول خميرة التحول عالية الإنتاجية مع الروبوت مناولة السائل لأداء شاشة overexpression البلازميد ، وذلك باستخدام مكتبة المحتشدة من الخميرة البلازميدات 5500. لقد تم استخدام هذه الشاشات لتحديد معدلات السمية الوراثية المرتبطة تراكم تجميع البروتينات البشرية المعرضة للمرض الاعصاب. الأساليب المقدمة هنا هي قابلة للتكيف بسهولة لدراسة الظواهر الخلوية الأخرى ذات الاهتمام.
Protocol
Discussion
هنا نطرح على بروتوكول لتنفيذ عالية الإنتاجية الشاشة overexpression البلازميد في الخميرة. هذا النهج يسمح للفحص السريع وغير منحازة عن المعدلات الوراثية للكثير من الظواهر الخلوية المختلفة. باستخدام هذا النهج ، يمكن للباحث الشاشة جزء كبير من الجينوم الخميرة في غضون أسابيع. هذ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال منحة من مركز للبحوث باكارد ALS في جامعة جونز هوبكنز (المدير العام المساعد) ، وجائزة من مدير المعاهد الوطنية للصحة ومبتكر جديد 1DP2OD004417 – 01 (المدير العام المساعد) ، NIH R01 NS065317 (المدير العام المساعد) ، وجائزة الباحث ألن ريتا المؤسسة. مساعد المدير العام لمركز بيو باحثة في العلوم الطبية الحيوية ، وبدعم من صناديق بيو الخيرية.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog number |
|---|---|---|
| BioRobot RapidPlate | Qiagen | 9000490 |
| 96 bolt replicator (frogger) | V&P Scientific | VP404 |
| FLEXGene ORF Library | Institute of Proteomics, Harvard Medical School | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5810R |
| 500mL baffled flask | Bellco | 2543-00500 |
| 2.8L triple-baffled Fernbach flask | Bellco | 2551-02800 |
| 100μL Rapidplate pipette tips | Axygen | ZT-100-R-S |
| 200μL Rapidplate pipette tips | Axygen | ZT-200-R-S |
References
- Nurse, P. The Nobel Prize and beyond: an interview with Sir Paul Nurse. Interview by Susan R. Owens. EMBO Rep. 3, 204-206 (2002).
- Hartwell, L. H. Nobel Lecture. Yeast and cancer. Biosci Rep. 22, 373-394 (2002).
- Stevens, T., Esmon, B., Schekman, R. Early stages in the yeast secretory pathway are required for transport of carboxypeptidase Y to the vacuole. Cell. 30, 439-448 (1982).
- Novick, P., Ferro, S., Schekman, R. Order of events in the yeast secretory pathway. Cell. 25, 461-469 (1981).
- Novick, P., Field, C., Schekman, R. Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway. Cell. 21, 205-215 (1980).
- Sopko, R. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21, 319-330 (2006).
- Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. A suite of Gateway((R)) cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 24, 913-919 (2007).
- Gelperin, D. M. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19, 2816-2826 (2005).
- Hu, Y. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17, 536-543 (2007).
- Giaever, G. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
- Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nat Rev Genet. 8, 437-449 (2007).
- Mnaimneh, S. Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles. Cell. 118, 31-44 (2004).
- Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Schuldiner, M. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123, 507-519 (2005).
- Tong, A. H. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science. 294, 2364-2368 (2001).
- Tong, A. H. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303, 808-813 (2004).
- Neumann, M. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314, 130-133 (2006).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 6439-6444 (2008).
- Elden, A. C. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
- Johnson, B. S. TDP-43 is intrinsically aggregation-prone, and amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations accelerate aggregation and increase toxicity. J Biol Chem. 284, 20329-20339 (2009).
- Cooper, A. A. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Gitler, A. D. Beer and Bread to Brains and Beyond: Can Yeast Cells Teach Us about Neurodegenerative Disease?. Neurosignals. 16, 52-62 (2008).
- Gitler, A. D. Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity. Nat Genet. 41, 308-315 (2009).
