Высокая пропускная способность дрожжей плазмиды экрана Сверхэкспрессия
Summary
Здесь мы опишем плазмиды экране гиперэкспрессия в<em> Saccharomyces CEREVISIAE</em>, С помощью выстроились плазмиды библиотеки и высокой пропускной способности дрожжей преобразования протоколов с жидкого робота обработки.
Abstract
Почкующихся дрожжей, Saccharomyces CEREVISIAE, представляет собой мощную систему модель для определения фундаментальных механизмов многих важных клеточных процессов, в том числе имеет непосредственное отношение к болезни человека. Из-за короткого времени генерации и хорошо изученных геномов, основным преимуществом экспериментальной модели системы дрожжей способность выполнять генетических экранов, чтобы идентифицировать гены и пути, которые участвуют в данном процессе. За последние тридцать лет такие генетические экраны были использованы для выяснения клеточного цикла, секреторный путь, и многие другие высоко консервативные аспекты эукариотической клеточной биологии 1-5. В последние несколько лет, несколько библиотек genomewide штаммов дрожжей и плазмиды были получены 6-10. Эти коллекции позволяют сейчас для систематического допроса функции гена использованием усиления и потерей функции подходы 11-16. Здесь мы предлагаем подробный протокол для использования высокопроизводительного протокола трансформация дрожжи с жидкого робота выполнять обработку плазмиды экране гиперэкспрессия, используя выстроил библиотеку в 5500 плазмиды дрожжей. Мы используем эти экраны для выявления генетических модификаторов токсичность, связанная с накоплением агрегации подверженных человека нейродегенеративные заболевания белки. Методы, представленные здесь, могут быть легко приспособлены к изучению других клеточных фенотипов интерес.
Protocol
Discussion
Здесь мы приводим протокол для выполнения высокой пропускной способности плазмиды экране гиперэкспрессия в дрожжах. Такой подход позволяет оперативно и объективную скрининг на генетические модификаторы многих различных клеточных фенотипов. Используя этот подход, исследователь мож…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом Packard Центр ALS исследований в Университете Джона Хопкинса (ADG), Нью-премии Новатор NIH директора 1DP2OD004417-01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), Рита Аллен Фонд ученый Award. ADG является выпускником школы Пью в медико-биологических наук, при поддержке Благотворительные фонды Пью.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog number |
|---|---|---|
| BioRobot RapidPlate | Qiagen | 9000490 |
| 96 bolt replicator (frogger) | V&P Scientific | VP404 |
| FLEXGene ORF Library | Institute of Proteomics, Harvard Medical School | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5810R |
| 500mL baffled flask | Bellco | 2543-00500 |
| 2.8L triple-baffled Fernbach flask | Bellco | 2551-02800 |
| 100μL Rapidplate pipette tips | Axygen | ZT-100-R-S |
| 200μL Rapidplate pipette tips | Axygen | ZT-200-R-S |
References
- Nurse, P. The Nobel Prize and beyond: an interview with Sir Paul Nurse. Interview by Susan R. Owens. EMBO Rep. 3, 204-206 (2002).
- Hartwell, L. H. Nobel Lecture. Yeast and cancer. Biosci Rep. 22, 373-394 (2002).
- Stevens, T., Esmon, B., Schekman, R. Early stages in the yeast secretory pathway are required for transport of carboxypeptidase Y to the vacuole. Cell. 30, 439-448 (1982).
- Novick, P., Ferro, S., Schekman, R. Order of events in the yeast secretory pathway. Cell. 25, 461-469 (1981).
- Novick, P., Field, C., Schekman, R. Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway. Cell. 21, 205-215 (1980).
- Sopko, R. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21, 319-330 (2006).
- Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. A suite of Gateway((R)) cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 24, 913-919 (2007).
- Gelperin, D. M. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19, 2816-2826 (2005).
- Hu, Y. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17, 536-543 (2007).
- Giaever, G. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
- Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nat Rev Genet. 8, 437-449 (2007).
- Mnaimneh, S. Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles. Cell. 118, 31-44 (2004).
- Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Schuldiner, M. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123, 507-519 (2005).
- Tong, A. H. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science. 294, 2364-2368 (2001).
- Tong, A. H. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303, 808-813 (2004).
- Neumann, M. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314, 130-133 (2006).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 6439-6444 (2008).
- Elden, A. C. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
- Johnson, B. S. TDP-43 is intrinsically aggregation-prone, and amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations accelerate aggregation and increase toxicity. J Biol Chem. 284, 20329-20339 (2009).
- Cooper, A. A. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Gitler, A. D. Beer and Bread to Brains and Beyond: Can Yeast Cells Teach Us about Neurodegenerative Disease?. Neurosignals. 16, 52-62 (2008).
- Gitler, A. D. Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity. Nat Genet. 41, 308-315 (2009).
