High-throughput Hefeplasmid Überexpression Bildschirm
Summary
Hier beschreiben wir ein Plasmid Überexpression Bildschirm in<em> Saccharomyces cerevisiae</em>, Mit einem Array-Plasmid-Bibliothek und einem High-Throughput-Hefe-Transformation-Protokoll mit einem Liquid-Handling-Roboter.
Abstract
Die Bierhefe, Saccharomyces cerevisiae, ist ein leistungsfähiges Modell für die Definition grundlegenden Mechanismen von vielen wichtigen zellulären Prozessen, einschließlich solcher mit unmittelbarer Relevanz für menschliche Krankheiten. Wegen seiner kurzen Generationszeit und gut charakterisierten Genoms, ist ein großer experimenteller Vorteil der Hefe Modellsystem die Fähigkeit, genetische Screens durchgeführt, um Gene und Signalwege, die in einem bestimmten Prozess beteiligt sind zu identifizieren. Im Laufe der letzten 30 Jahre solche genetischen Screens wurden verwendet, um den Zellzyklus, Sekretionsweg, und viele weitere hochkonservierte Aspekte der eukaryotischen Zelle Biologie 1-5 aufzuklären. In den letzten Jahren haben mehrere genomweiten Bibliotheken Hefestämme und Plasmide wurden 6-10 generiert. Diese Sammlungen erlauben nun für die systematische Befragung der Genfunktion mit Gewinn-und Verlust-of-function Ansätze 11-16. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für den Einsatz eines High-Throughput-Hefe-Transformation-Protokoll mit einem Liquid-Handling-Roboter ein Plasmid Überexpression Bildschirm durchführen, mit einem Array-Bibliothek von 5.500 Hefeplasmide. Wir verwenden diese Bildschirme zu genetischen Modifikatoren der Toxizität mit der Akkumulation von Aggregation neigende menschliche neurodegenerative Erkrankung Proteinen assoziiert zu identifizieren. Die hier vorgestellten Methoden sind leicht an das Studium der anderen zellulären Phänotypen von Interesse.
Protocol
Discussion
Hier präsentieren wir ein Protokoll zu einem High-Throughput-Plasmid-Überexpression in der Hefe Bildschirm ausführen. Dieser Ansatz ermöglicht die schnelle und unvoreingenommene Screening auf genetische Modifikatoren von vielen verschiedenen zellulären Phänotypen. Mit diesem Ansatz kann ein Forscher einen bedeutenden Teil des Hefe-Genoms in einer Angelegenheit von Wochen-Bildschirm. Diese unvoreingenommene Herangehensweise ermöglicht auch die Identifizierung von Modifikatoren, die nicht vorhergesagt basierend auf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem Packard Zentrum für ALS-Forschung an der Johns Hopkins (ADG), ein NIH Director des New Innovator Award 1DP2OD004417-01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), der Rita Allen Foundation Scholar Award unterstützt. ADG ist ein Pew Scholar in der Biomedizin, von The Pew Charitable Trusts unterstützt.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog number |
|---|---|---|
| BioRobot RapidPlate | Qiagen | 9000490 |
| 96 bolt replicator (frogger) | V&P Scientific | VP404 |
| FLEXGene ORF Library | Institute of Proteomics, Harvard Medical School | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5810R |
| 500mL baffled flask | Bellco | 2543-00500 |
| 2.8L triple-baffled Fernbach flask | Bellco | 2551-02800 |
| 100μL Rapidplate pipette tips | Axygen | ZT-100-R-S |
| 200μL Rapidplate pipette tips | Axygen | ZT-200-R-S |
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