תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך
Summary
כאן אנו מתארים מסך overexpression פלסמיד ב<em> Saccharomyces cerevisiae</em>, באמצעות פלסמיד ספריה ערוכים ו תפוקה גבוהה טרנספורמציה פרוטוקול שמרים עם רובוט טיפול נוזלי.
Abstract
נבגי שמרים, cerevisiae Saccharomyces, היא מערכת מודל עוצמה להגדרת המנגנונים הבסיסיים של תהליכים תאיים רבים חשובים, כולל אלה עם שייכות ישירה מחלות אנושיות. בגלל הזמן הקצר של הדור שלה היטב מאופיין הגנום, יתרון הניסוי העיקריים של מערכת מודל שמרים היא היכולת לבצע מסכי גנטית כדי לזהות גנים המסלולים המעורבים בתהליך נתון. במשך שלושים השנים האחרונות מסכי גנטי כזה כבר בשימוש על מנת להבהיר את מחזור התא, מסלול הפרשה, והיבטים רבים יותר שמור ביותר של ביולוגיה של התא אוקריוטים 1-5. בשנים האחרונות, ספריות genomewide מספר זני שמרים פלסמידים נוצרו 6-10. אוספים אלה מאפשרים כעת לחקירה שיטתית של תפקוד הגן באמצעות רווח, והפסד של פונקציה גישות 11-16. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לשימוש פרוטוקול תפוקה גבוהה טרנספורמציה שמרים עם רובוט טיפול הנוזל לבצע מסך overexpression פלסמיד, באמצעות ספריה ערוכים של 5500 פלסמידים שמרים. אנחנו משתמשים במסכים אלה כדי לזהות מכפילי הגנטי של רעילות הקשורות הצטברות של צבירה נוטה חלבונים אנושיים מחלות ניווניות. השיטות שהוצגו כאן הם להתאמה בקלות ללימוד פנוטיפים סלולריים אחרים בעלי עניין.
Protocol
Discussion
כאן אנו מציגים פרוטוקול לבצע המסך תפוקה גבוהה overexpression פלסמיד בשמרים. גישה זו מאפשרת להקרנה מהירה משוחדת עבור מכפילי הגנטי של פנוטיפים רבים סלולריים שונים. שימוש בגישה זו, חוקר יכול המסך חלק ניכר של הגנום שמרים ב עניין של שבועות. גישה זו משוחדת גם מאפשר זיהוי של מכפילי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המרכז Packard עבור ALS מחקר באוניברסיטת ג'ונס הופקינס (ADG), פרס ממציא ניו מנהל NIH 1DP2OD004417-01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), אלן ריטה פרס קרן Scholar. ADG הוא חוקר Pew במדעי ביו, נתמך על ידי Pew Charitable Trusts.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog number |
|---|---|---|
| BioRobot RapidPlate | Qiagen | 9000490 |
| 96 bolt replicator (frogger) | V&P Scientific | VP404 |
| FLEXGene ORF Library | Institute of Proteomics, Harvard Medical School | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5810R |
| 500mL baffled flask | Bellco | 2543-00500 |
| 2.8L triple-baffled Fernbach flask | Bellco | 2551-02800 |
| 100μL Rapidplate pipette tips | Axygen | ZT-100-R-S |
| 200μL Rapidplate pipette tips | Axygen | ZT-200-R-S |
References
- Nurse, P. The Nobel Prize and beyond: an interview with Sir Paul Nurse. Interview by Susan R. Owens. EMBO Rep. 3, 204-206 (2002).
- Hartwell, L. H. Nobel Lecture. Yeast and cancer. Biosci Rep. 22, 373-394 (2002).
- Stevens, T., Esmon, B., Schekman, R. Early stages in the yeast secretory pathway are required for transport of carboxypeptidase Y to the vacuole. Cell. 30, 439-448 (1982).
- Novick, P., Ferro, S., Schekman, R. Order of events in the yeast secretory pathway. Cell. 25, 461-469 (1981).
- Novick, P., Field, C., Schekman, R. Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway. Cell. 21, 205-215 (1980).
- Sopko, R. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21, 319-330 (2006).
- Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. A suite of Gateway((R)) cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 24, 913-919 (2007).
- Gelperin, D. M. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19, 2816-2826 (2005).
- Hu, Y. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17, 536-543 (2007).
- Giaever, G. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
- Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nat Rev Genet. 8, 437-449 (2007).
- Mnaimneh, S. Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles. Cell. 118, 31-44 (2004).
- Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Schuldiner, M. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123, 507-519 (2005).
- Tong, A. H. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science. 294, 2364-2368 (2001).
- Tong, A. H. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303, 808-813 (2004).
- Neumann, M. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314, 130-133 (2006).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 6439-6444 (2008).
- Elden, A. C. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
- Johnson, B. S. TDP-43 is intrinsically aggregation-prone, and amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations accelerate aggregation and increase toxicity. J Biol Chem. 284, 20329-20339 (2009).
- Cooper, A. A. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Gitler, A. D. Beer and Bread to Brains and Beyond: Can Yeast Cells Teach Us about Neurodegenerative Disease?. Neurosignals. 16, 52-62 (2008).
- Gitler, A. D. Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity. Nat Genet. 41, 308-315 (2009).
