Haut débit écran surexpression plasmide de levure
Summary
Nous décrivons ici un écran surexpression plasmide dans<em> Saccharomyces cerevisiae</em>, En utilisant une bibliothèque vêtu plasmide et un protocole de haut débit de la levure de transformation avec un robot de manipulation de liquides.
Abstract
Le bourgeonnement de levure Saccharomyces cerevisiae, est un système puissant modèle pour définir les mécanismes fondamentaux de nombreux processus cellulaires importants, y compris ceux en rapport direct avec la maladie humaine. En raison de son temps de génération court et bien caractérisés génome, un avantage majeur d'expérimentation du système modèle la levure est la capacité à effectuer des criblages génétiques pour identifier les gènes et les voies qui sont impliquées dans un processus donné. Au cours des trente dernières années tels cribles génétiques ont été utilisés pour élucider le cycle cellulaire, voie de sécrétion, et de nombreux autres aspects de la biologie hautement conservée cellule eucaryote 1-5. Au cours des dernières années, plusieurs bibliothèques genomewide des souches de levures et plasmides ont été générés 6-10. Ces collections permettent maintenant de l'interrogation systématique de la fonction des gènes en utilisant gain et la perte de fonction des approches 11-16. Ici nous fournissons un protocole détaillé pour l'utilisation d'un protocole de haut débit de la levure de transformation avec un robot de manipulation de liquides pour effectuer un écran surexpression plasmidique, en utilisant une bibliothèque de 5.500 vêtu plasmides de levure. Nous avons utilisé ces écrans pour identifier modificateurs génétiques de la toxicité associée à l'accumulation de l'agrégation des protéines humaines exposées aux maladies neurodégénératives. Les méthodes présentées ici sont facilement adaptables à l'étude d'autres phénotypes cellulaires d'intérêt.
Protocol
Discussion
Nous présentons ici un protocole pour effectuer un écran haut débit surexpression plasmide dans la levure. Cette approche permet le criblage rapide et impartiale pour les modificateurs génétiques de beaucoup de différents phénotypes cellulaires. En utilisant cette approche, un chercheur peut filtrer une partie importante du génome de la levure dans une affaire de semaines. Cette approche impartiale permet également d'identifier les modificateurs, qui peuvent ne pas avoir été prédit sur la base des conclu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention du Centre pour la recherche sur la SLA Packard à la Johns Hopkins (ADG), Prix d'un directeur des NIH Innovateur Nouveau 1DP2OD004417-01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), la Fondation Rita Allen Scholar Award. ADG est une bourse d'études Pew dans les sciences biomédicales, soutenu par le Pew Charitable Trusts.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog number |
|---|---|---|
| BioRobot RapidPlate | Qiagen | 9000490 |
| 96 bolt replicator (frogger) | V&P Scientific | VP404 |
| FLEXGene ORF Library | Institute of Proteomics, Harvard Medical School | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5810R |
| 500mL baffled flask | Bellco | 2543-00500 |
| 2.8L triple-baffled Fernbach flask | Bellco | 2551-02800 |
| 100μL Rapidplate pipette tips | Axygen | ZT-100-R-S |
| 200μL Rapidplate pipette tips | Axygen | ZT-200-R-S |
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