High-throughput gist Plasmide Overexpressie Screen
Summary
Hier beschrijven we een plasmide overexpressie scherm in<em> Saccharomyces cerevisiae</em>, Met behulp van een plasmide gekleed bibliotheek en een high-throughput gist transformatie protocol met een liquid handling robot.
Abstract
De gist Saccharomyces cerevisiae, is een krachtig model systeem voor het definiëren van fundamentele mechanismen van de vele belangrijke cellulaire processen, waaronder die met directe relevantie voor de menselijke ziekte. Vanwege de korte generatietijd en goed gekarakteriseerd genoom, een grote experimentele voordeel van de gist modelsysteem is de mogelijkheid om genetische screens uit te voeren om genen en paden die betrokken zijn bij een bepaald proces te identificeren. In de afgelopen dertig jaar een dergelijke genetische screens zijn gebruikt om de celcyclus, secretieroute, en nog veel meer sterk geconserveerde aspecten van de eukaryote cel biologie 1-5 toe te lichten. In de afgelopen jaren zijn er verschillende genoomwijde bibliotheken van gist stammen en plasmiden is gegenereerd 6-10. Deze collecties nu zorgen voor de systematische ondervraging van gen-functie met behulp van winst-en verlies-van-functie benaderingen 11-16. Hier hebben we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van een high-throughput gist transformatie protocol met een liquid handling robot aan een plasmide overexpressie scherm uit te voeren, met behulp van een gekleed bibliotheek van 5.500 gist plasmiden. We hebben gebruik gemaakt van deze schermen aan genetische factoren van toxiciteit in verband met de accumulatie van aggregatie-gevoelige humane neurodegeneratieve ziekten eiwitten te identificeren. De methoden die hier gepresenteerd zijn gemakkelijk aan te passen aan de studie van andere cellulaire fenotypes van belang.
Protocol
Discussion
Hier presenteren wij een protocol om een high-throughput plasmide overexpressie screen in gist uit te voeren. Deze aanpak maakt het mogelijk om snelle en onpartijdige screening op genetische factoren van een groot aantal verschillende cellulaire fenotypes. Met behulp van deze aanpak, een onderzoeker kan een aanzienlijk deel van de gist genoom scherm in een kwestie van weken. Deze onpartijdige aanpak maakt het ook mogelijk voor de identificatie van modifiers, die niet mag worden voorspeld op basis van eerdere bevin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het Packard Center voor ALS onderzoek in Johns Hopkins (ADG), Nieuw-Innovator een NIH Director's Award 1DP2OD004417-01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), de Rita Allen Foundation Scholar Award. ADG is een Pew Scholar in de Biomedische Wetenschappen, ondersteund door The Pew Charitable Trusts.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog number |
|---|---|---|
| BioRobot RapidPlate | Qiagen | 9000490 |
| 96 bolt replicator (frogger) | V&P Scientific | VP404 |
| FLEXGene ORF Library | Institute of Proteomics, Harvard Medical School | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5810R |
| 500mL baffled flask | Bellco | 2543-00500 |
| 2.8L triple-baffled Fernbach flask | Bellco | 2551-02800 |
| 100μL Rapidplate pipette tips | Axygen | ZT-100-R-S |
| 200μL Rapidplate pipette tips | Axygen | ZT-200-R-S |
References
- Nurse, P. The Nobel Prize and beyond: an interview with Sir Paul Nurse. Interview by Susan R. Owens. EMBO Rep. 3, 204-206 (2002).
- Hartwell, L. H. Nobel Lecture. Yeast and cancer. Biosci Rep. 22, 373-394 (2002).
- Stevens, T., Esmon, B., Schekman, R. Early stages in the yeast secretory pathway are required for transport of carboxypeptidase Y to the vacuole. Cell. 30, 439-448 (1982).
- Novick, P., Ferro, S., Schekman, R. Order of events in the yeast secretory pathway. Cell. 25, 461-469 (1981).
- Novick, P., Field, C., Schekman, R. Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway. Cell. 21, 205-215 (1980).
- Sopko, R. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21, 319-330 (2006).
- Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. A suite of Gateway((R)) cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 24, 913-919 (2007).
- Gelperin, D. M. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19, 2816-2826 (2005).
- Hu, Y. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17, 536-543 (2007).
- Giaever, G. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
- Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nat Rev Genet. 8, 437-449 (2007).
- Mnaimneh, S. Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles. Cell. 118, 31-44 (2004).
- Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Schuldiner, M. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123, 507-519 (2005).
- Tong, A. H. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science. 294, 2364-2368 (2001).
- Tong, A. H. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303, 808-813 (2004).
- Neumann, M. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314, 130-133 (2006).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 6439-6444 (2008).
- Elden, A. C. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
- Johnson, B. S. TDP-43 is intrinsically aggregation-prone, and amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations accelerate aggregation and increase toxicity. J Biol Chem. 284, 20329-20339 (2009).
- Cooper, A. A. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Gitler, A. D. Beer and Bread to Brains and Beyond: Can Yeast Cells Teach Us about Neurodegenerative Disease?. Neurosignals. 16, 52-62 (2008).
- Gitler, A. D. Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity. Nat Genet. 41, 308-315 (2009).
