उच्च throughput खमीर प्लाज्मिड Overexpression स्क्रीन
Summary
यहाँ हम में एक प्लाज्मिड overexpression स्क्रीन का वर्णन<em> Saccharomyces cerevisiae</em> एक तरल से निपटने रोबोट के साथ एक arrayed प्लाज्मिड पुस्तकालय और उच्च throughput एक खमीर परिवर्तन प्रोटोकॉल का उपयोग.
Abstract
नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiae, मानव रोग के लिए प्रत्यक्ष प्रासंगिकता के साथ उन सहित कई महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं के बुनियादी तंत्र को परिभाषित करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है. अपनी छोटी पीढ़ी समय और अच्छी तरह से विशेषता जीनोम की वजह से, खमीर मॉडल प्रणाली के एक प्रमुख प्रयोगात्मक लाभ के लिए आनुवंशिक स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए जीन और मार्ग है कि किसी भी प्रक्रिया में शामिल हैं की पहचान करने की क्षमता है. पिछले तीस साल में इस तरह के आनुवंशिक स्क्रीन सेल चक्र, स्रावी मार्ग, और यूकेरियोटिक सेल 1-5 जीव विज्ञान के कई अधिक उच्च संरक्षित पहलुओं को स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. पिछले कुछ वर्षों में, खमीर उपभेदों और plasmids के कई genomewide पुस्तकालयों 6-10 उत्पन्न किया गया है. इन संग्रहों में अब जीन समारोह के व्यवस्थित लाभ और हानि के समारोह 11-16 दृष्टिकोण का उपयोग कर पूछताछ के लिए अनुमति देते हैं . यहाँ हम एक तरल से निपटने रोबोट एक प्लाज्मिड overexpression स्क्रीन प्रदर्शन के साथ उच्च throughput एक खमीर परिवर्तन प्रोटोकॉल के उपयोग के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, 5500 खमीर plasmids के एक arrayed पुस्तकालय का उपयोग कर. हम इन स्क्रीन का उपयोग किया गया एकत्रीकरण प्रवण मानव neurodegenerative रोग प्रोटीन के संचय के साथ जुड़े विषाक्तता के आनुवंशिक संशोधक की पहचान. यहाँ प्रस्तुत तरीकों को आसानी से ब्याज की अन्य सेलुलर phenotypes के अध्ययन के लिए अनुकूलनीय रहे हैं.
Protocol
Discussion
यहाँ हम एक प्रोटोकॉल करने के लिए खमीर में एक उच्च throughput प्लाज्मिड overexpression स्क्रीन प्रदर्शन मौजूद है. इस दृष्टिकोण तेजी से और निष्पक्ष जांच के लिए कई अलग अलग सेलुलर phenotypes की आनुवंशिक संशोधक के लिए अनुमति देत?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम जॉन्स हॉपकिन्स पर पैकार्ड ए एल एस अनुसंधान के लिए केंद्र (एडीजी), एक NIH निदेशक का नया अन्वेषक पुरस्कार 1DP2OD004417 01 – (एडीजी), एनआईएच R01 NS065317 (एडीजी), रीता एलन फाउंडेशन विद्वान पुरस्कार से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. एडीजी बायोमेडिकल साइंसेज में एक बेंच विद्वान, बेंच चैरिटेबल ट्रस्ट द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog number |
|---|---|---|
| BioRobot RapidPlate | Qiagen | 9000490 |
| 96 bolt replicator (frogger) | V&P Scientific | VP404 |
| FLEXGene ORF Library | Institute of Proteomics, Harvard Medical School | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5810R |
| 500mL baffled flask | Bellco | 2543-00500 |
| 2.8L triple-baffled Fernbach flask | Bellco | 2551-02800 |
| 100μL Rapidplate pipette tips | Axygen | ZT-100-R-S |
| 200μL Rapidplate pipette tips | Axygen | ZT-200-R-S |
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