Summary
Para seguir la progresión de una respuesta inmune con el tiempo dentro del mismo ratón, los ganglios linfáticos se pueden extirpar mediante cirugía secuencial. Aquí se describe cómo esta técnica se puede realizar.
Abstract
En el campo de la inmunología, para entender la progresión de una respuesta inmune contra una vacuna, una infección o un tumor, la respuesta es seguido a menudo con el tiempo. Del mismo modo, el estudio de la homeostasis de los linfocitos se requieren experimentos en curso. Realizar estos estudios dentro del mismo ratón es ideal para reducir la variabilidad experimental, así como el número de ratones utilizados. La extracción de sangre permite un rendimiento de experimentos de tiempo, pero sólo se da información sobre los linfocitos circulantes y proporciona un número limitado de células 1-4. Dado que los linfocitos que circulan por el cuerpo y que residen en los ganglios linfáticos tienen propiedades diferentes, es importante examinar ambas localidades. La eliminación secuencial de los ganglios linfáticos mediante cirugía ofrece una oportunidad única para seguir una respuesta inmune o la expansión de células inmunes en el mismo ratón a través del tiempo. Además, esta técnica produce entre 1-2x10 6 células por ganglio linfático que es suficiente para PErform caracterización fenotípica y / o ensayos funcionales. La cirugía secuencial de los ganglios linfáticos o linfadenectomía ha sido utilizado con éxito por nosotros y otros 5-11. Aquí se describe cómo los nódulos linfáticos inguinales braquial y se puede quitar haciendo una pequeña incisión en la piel de un ratón anestesiados. Dado que la cirugía es superficial y se hace rápidamente, el ratón se recupera muy rápidamente, cura bien y no experimenta dolor excesivo. Cada segundo día, es posible cosechar uno o dos ganglios linfáticos permitiendo experimentos de tiempo. Esta técnica es por tanto adecuado para estudiar las características de los ganglios linfáticos de linfocitos que residen en el tiempo. Este enfoque es adecuado para diferentes diseños experimentales y creemos que muchos laboratorios se beneficiarán de la realización de cirugías secuenciales de los ganglios linfáticos.
Protocol
1. Preparación Antes de la cirugía
Los ratones fueron tratados de acuerdo con el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales Directrices.
- Ratones anestesiar por inyección de ketamina / xilazina (150/300 mg / kg, ip) o por inhalación de isoflurano (2%, oxígeno 1L). Si está disponible, isoflurano se debe utilizar, ya que permite un mejor control de tiempo de anestesia y profundidad. Además, el oxígeno se administra al mismo tiempo que soporta las funciones fisiológicas de los animales. Además, isoflurano está directamente eliminado por los pulmones y por lo tanto no requiere metabolismo hepático o renal.
- Inyectar buprenorfina (0,05 - 0,1 mg / kg, sc) o analgésico otro.
- Aplique una pomada en los ojos de ratón antes de la cirugía para evitar la sequedad del ojo (si isoflurano se utiliza).
- Compruebe que el ratón está dormido apretando sus garras y rodando su cola. Si el ratón no reacciona, proceder con la cirugía.
2. La Cirugía
- Ponga el mouse sobre un costado.
- Localización de la región donde se llevará a cabo una incision, dependiendo de la LN que desea cosechar. (Figura 1).
- Aplicar clorhexidina, o desinfectante otro, a esa región.
- Hacer una pequeña incisión con tijeras (aproximadamente 5 mm) o bien en la parte posterior de la extremidad anterior o por encima de la pata trasera cerca del abdomen (Figura 1).
- Quitar los pelos sueltos que han cortado con las pinzas. Si lo prefiere, puede afeitarse el ratón antes de hacer la incisión. Sin embargo, se alarga el procedimiento y se encuentra que no es necesario puesto que, como se muestra aquí, no mejora la infección curación o disminución, que son muy raros.
- Estirar la incisión con 2 pinzas con el fin de ver la LN. La incisión puede llegar a 10 mm. El LN parece gris o más oscuro que la grasa que rodea.
- Apriete la fascia (la membrana delgada que cubre la grasa y el tejido) en la parte superior de la LN con una pinza y tire suavemente sin romper el tejido circundante.
- Colocar las pinzas segunda medida de lo posible underneath la LN. Con las pinzas en primer lugar, romper la fascia y retire la LN. Si usted ha recogido con éxito la LN, una mancha de sangre debe aparecer en el lugar donde se encontraba la LN con anterioridad. Nótese que los disipadores de LN en solución isotónica. Esta simple prueba le permite comprobar que se han extraído una LN y el tejido no graso.
- Compruebe que no hay pelos en la herida.
- Cerrar la incisión por pegar las 2 partes de piel juntos (el interior de la piel) y por grapado con un clip. Utilizamos algunos Clip Michel con las pinzas se aplican. Instalar uno o dos clips, dependiendo del tamaño de la incisión. Muy a menudo, los clips se caen cuando el tejido se cura.
3. Cuidado Postoperatorio
- Añadir un poco de alimento húmedo en el fondo de la jaula por lo que los ratones pueden alimentar fácilmente después de la cirugía.
- Acerca de 6 a 8 horas después de la cirugía, comprobar los ratones para asegurarse de que no experimenta dolor. Observe cuidadosamente su comportamiento (la postura, la marcha, eninteracción con los congéneres y la apariencia de la piel). Si el aspecto general de los ratones es pobre, administrar una segunda dosis de buprenorfina. Al día siguiente, los ratones deben recuperar su comportamiento normal de lo contrario continuar con la administración de buprenorfina. Los ratones nunca debe llegar a los extremos previamente determinados y aceptados por el Consejo de Protección de los Animales. Es posible que desee buscar consejo y ayuda de su técnico en animales vivero cuidado.
4. Manejo de los ganglios del nodo
- En el laboratorio, para obtener una suspensión de células individuales, disociar la LN como por su procedimiento habitual. Pulsamos LN contra los toboganes helados y rutinariamente obtienen 1-2 x 10 6 células por LN. Por otra parte, preparamos la LN para la extracción de RNA.
- Teñir las células según el protocolo habitual. Usted debe obtener esperados LN perfiles de citometría de flujo.
5. Los resultados representativos
Un ejemplo de p dispersión hacia adelante y el ladomucho se muestra para LNs cosechadas a partir de un ratón anestesiado mediante cirugía o de un ratón sacrificado (Figura 2). El perfil y los porcentajes de células en la puerta de linfocitos en vivo son las mismas que demuestra que la cirugía de LN es una técnica apropiada para las células de la cosecha.
Figura 1. Inguinal y localización LN braquial en el ratón. A. La LN inguinal se encuentra justo encima de la pata trasera, ligeramente hacia el vientre. B. La LN braquial se encuentra detrás de la pata delantera.
Figura 2. Perfil citometría de flujo de los linfocitos obtenidos después de la cirugía LN. Y la cara perfiles de dispersión se muestran para LN cosechadas a partir de un Anesthetized ratón mediante cirugía (A) o de un ratón sacrificado (B). LN han sido recolectados, disociado y se analizaron en un citómetro de flujo. Los porcentajes de células en la puerta de linfocitos en vivo se muestran.
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Discussion
Hemos descrito un protocolo de cirugía LN que puede aplicarse a muchos sistemas experimentales. Aunque es muy útil para seguir la respuesta inmune o la homeostasis de las células inmunitarias, esta técnica tiene algunas limitaciones. En primer lugar, sólo cuatro LN pueden ser cosechadas. En segundo lugar, estudió la respuesta inmune debe ser sistémica u ocurre en las inguinales superficiales o braquial (piel de drenaje) LNS. Finalmente, el número de células recolectadas se ve influida por la calidad de la eliminación LN, una limitación técnica que puede contribuir a la variabilidad experimental cuando los números absolutos de células se necesitan. Sin embargo, el porcentaje de células diana, por sí misma, puede proporcionar información pertinente y exacta particularmente cuando el tamaño de LN no varía en diferentes condiciones experimentales. Afortunadamente, una vez que la técnica es bien dominado, la calidad de la eliminación LN mejora, permitiendo el número de células altamente reproducibles en cada LN. Creemos que a pesar de estas limitaciones, la cirugía ofrece ventajas clave LN para estudiarla progresión de las respuestas inmunes. En primer lugar, la respuesta inmune con el tiempo se puede seguir en un ratón dado, disminuyendo la variabilidad experimental, así como el número de ratones utilizados. En segundo lugar, eventos tales como la homeostasis de linfocitos o iniciación respuesta inmune que ocurre en los LNS puede ser estudiado directamente. Otra ventaja importante es que más células se pueden recuperar de LN que a partir de sangre que permite la caracterización de células extendida. Esta técnica también es adecuado para otros fines tales como la genotipificación ratones transgénicos o el estudio de otras poblaciones de células que residen o el tráfico a través de la LNS, como las células B, células dendríticas y los macrófagos.
Nuestro laboratorio y otros han estado utilizando esta técnica desde hace varios años y nunca hemos observado ninguna interferencia en el curso de la respuesta inmune 7-9,12,13 y en la homeostasis inmune 5-7. LN cirugía secuencial en el descanso de tipo salvaje ratones C57BL / 6 no afectó el porcentaje y número de células CD4 + + células T 5-7. Por otra parte, también no afectó a estos parámetros en la LNS residuales. Además, durante el curso de una respuesta inmune, la eliminación LN superficial no afectan la cinética de la respuesta de células T ni la generación de células T de memoria 8,9,12,13. Por otra parte, comparación lado a lado de la respuesta de células T seguida, bien de la cirugía LN secuencial o sacrificado ratón no mostraron ninguna diferencia en nuestras manos (resultados no publicados y en la Figura 2). Por lo tanto, la cirugía LN secuencial es adecuado para estudiar la homeostasis de células T y la respuesta.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a Lesage Sylvie y todos los miembros del laboratorio para la lectura crítica del protocolo. Este trabajo fue apoyado por una beca (MOP-77545) de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR). Nathalie Labrecque con el apoyo de una Beca Senior de FRSQ y Mélissa Mathieu recibió un NSERC Alexander Graham Bell Canada Becas de Posgrado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Graefe Fine Pattern Premium Forceps | Harvard Apparatus | 52-2144 | Strongly Curved, 10 cm (4 in), 0.8 mm tip |
| Michel Clip Applying and Removing Forceps | Harvard Apparatus | 52-3779 | 12.5 cm (5 in) |
| Michel Clip 100 | Harvard Apparatus | 52-3746 | 7.5-1.75 mm |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Merck & Co. | ||
| Vetalar (Ketamine hydrochloride) | Bioniche Animal Health | DIN: 01989529 | |
| Rompun (Xylazine) | Bayer AG | DIN: 02169592 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | DIN: 02032384 | |
| Hypotears eye ointment | Novartis AG | DIN: 02133288 | |
| Baxedin (Clorhexidine gluconate 2% in isopropyl alcohol 70%) | Omega Engineering, Inc. | L0000017 | DIN: 02251477 |
References
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