Detección de interacciones de proteínas en la planta mediante un Gateway Compatible Complementación fluorescencia bimoleculares (BiFC) del sistema
Summary
Hemos desarrollado una técnica para probar interacciones proteína-proteína en las plantas. Una proteína amarilla fluorescente (YFP) se divide en dos fragmentos que no se superponen. Cada fragmento se clona en el marco de un gen de interés a través del sistema de puerta de enlace, lo que permite la expresión de proteínas de fusión. La reconstitución de la señal de YFP sólo ocurre cuando las proteínas interactúan investigación.
Abstract
Hemos desarrollado una técnica BiFC para probar la interacción entre dos proteínas in vivo. Esto se logra mediante la división de una proteína amarilla fluorescente (YFP) en dos fragmentos que no se superponen. Cada fragmento se clona en el marco de un gen de interés. Estas construcciones se pueden co-transformado en Nicotiana benthamiana a través de la transformación mediada por Agrobacterium, permitiendo la expresión de tránsito de las proteínas de fusión. La reconstitución de la señal de YFP sólo ocurre cuando las proteínas interactúan investigación 1-7. Para probar y validar las interacciones proteína-proteína, BiFC se puede utilizar junto con la levadura de dos híbridos (Y2H) ensayo. Esto puede detectar interacciones directas e indirectas que se puede contemplar en el Y2H. La tecnología Gateway es una plataforma universal que permite a los investigadores para llevar a los genes de interés (GOI) como la expresión en muchos sistemas de análisis funcional como sea posible 8,9. Tanto la orientación y el marco de lectura se puede mantener sin el uso de enzimas de restricción o la ligadura de expresión para hacer listas para clones. Como resultado, se pueden eliminar todos los pasos de la secuencia de nuevo para asegurar resultados consistentes a lo largo de los experimentos. Hemos creado una serie de vectores Gateway compatible BiFC y Y2H que proporcionar a los investigadores y fácil de utilizar herramientas para llevar a cabo ensayos tanto BiFC y Y2H 10. Aquí se demuestra la facilidad de uso de nuestro sistema BiFC para probar interacciones proteína-proteína en N. benthamiana plantas.
Protocol
Discussion
BiFC ensayo es una herramienta poderosa para el estudio de las interacciones proteína. A diferencia de la tradicional prueba de Y2H, BiFC no sólo permite la visualización de las interacciones proteína-proteína, sino que también proporciona más información sobre el complejo de proteínas, tales como localización subcelular. Además, es posible detectar interacciones directas e indirectas, siempre y cuando las dos proteínas candidatas pueden acercarse lo suficiente por un tercer socio. Como cualquier tecnología…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Nguyen Vi por leer el manuscrito y la asistencia de laboratorio en general.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 |
| MES hydrate | Sigma | M2933 |
| 1 mL slip-tip tuberculin syringe | BD | 309602 |
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