使用网关兼容双分子荧光互补（附设）系统在植物蛋白相互作用检测
Summary
我们已经开发出一种技术，以测试植物蛋白质相互作用。一个黄色荧光蛋白（YFP）被分成两个非重叠的片段。每个帧通过网关系统的兴趣基因片段克隆，使融合蛋白的表达。重组YFP的信号只发生在研讯的蛋白质相互作用。
Abstract
我们已经开发出一种附设的技术测试体内的蛋白质之间的相互作用。这是通过一个黄色荧光蛋白（YFP）分裂成两个非重叠的片段。每帧到一个感兴趣的基因片段克隆。然后，这些结构可以合作转化为烟草通过农杆菌介导的转化，使过境融合蛋白表达。重组YFP的信号只发生时，研讯的蛋白质相互作用1-7。测试和验证的蛋白质 – 蛋白质相互作用，附设可以一起使用的酵母双杂交（Y2H）检测。这可能会侦测到间接的相互作用，可在Y2H忽视。 Gateway技术是一个通用平台，使研究人员感兴趣的基因（GOI）穿梭成尽可能多的表达和功能分析系统， 可能 8,9 。可维持的方向和阅读框，而无需使用限制性内切酶或结扎表达准备克隆。因此，可以消除所有的重测序步骤，以确保在整个实验一致的结果。我们已经建立了一系列网关兼容附设和Y2H载体，提供易于使用的工具执行附设的Y2H检测的研究人员10。在这里，我们展示了易于使用我们的附设系统测试N中的蛋白质-蛋白质相互作用benthamiana植物。
Protocol
1。 农杆菌文化的制备 农杆菌菌株GV3101中转换网关兼容附设载体pEarleyGate201 YC和pEarleyGate202 – YN，每个包含一个融合构建印尼政府。 接种5毫升YEB（5G L – 1牛肉膏，1G L – 1酵母提取物，5G L – 1的蛋白胨，5G L – 1蔗糖，硫酸镁2MM 4，pH值7.2）附设的融合蛋白文化建设与农杆菌转化选择适当的抗生素。成长培养过夜，在28 ° C晃动在2…
Discussion
附设实验是研究蛋白质相互作用的有力工具。附设不同于传统的Y2H检测，不仅可以使蛋白质 – 蛋白质相互作用的可视化，而且还提供了更多的蛋白质复合体的亚细胞定位等信息。此外，它是可能的，只要检测到间接的相互作用的两个候选蛋白可以由第三方的合作伙伴带来足够接近。任何技术一样，附设有其局限性。由于附设的荧光基团形成的氧分子的要求，不能用于专性厌氧菌，在氧气存在的无?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢阮阅读的手稿和一般实验室援助第六。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 |
| MES hydrate | Sigma | M2933 |
| 1 mL slip-tip tuberculin syringe | BD | 309602 |
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Protein InteractionsPlantGateway CompatibleBimolecular Fluorescence ComplementationBiFC SystemYellow Fluorescent ProteinIn Vivo Interaction TestingNicotiana BenthamianaAgrobacterium Mediated TransformationFusion ProteinsYFP Signal ReconstitutionYeast Two Hybrid AssayIndirect InteractionsGateway TechnologyGene Of Interest (GOI)Expression And Functional Analysis SystemsOrientation And Reading Frame MaintenanceExpression-ready ClonesBiFC And Y2H VectorsEase Of Use
Cite This Article
Tian, G., Lu, Q., Zhang, L., Kohalmi, S. E., Cui, Y. Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System. J. Vis. Exp. (55), e3473, doi:10.3791/3473 (2011).