Detecção de interações proteína na planta através de um gateway de Complementação de fluorescência Compatível Bimolecular (BiFC) Sistema
Summary
Nós desenvolvemos uma técnica para testar interações proteína-proteína na planta. A proteína fluorescente amarela (YFP) é dividido em dois fragmentos não-sobrepostas. Cada fragmento é clonado em-frame de um gene de interesse através do sistema Gateway, permitindo a expressão de proteínas de fusão. Reconstituição do sinal YFP só ocorre quando as proteínas interagem inquérito.
Abstract
Nós desenvolvemos uma técnica BiFC para testar a interação entre duas proteínas in vivo. Isto é conseguido através da divisão de uma proteína fluorescente amarela (YFP) em dois fragmentos não-sobrepostas. Cada fragmento é clonado em-frame de um gene de interesse. Estas construções podem ser co-Nicotiana benthamiana transformada em via Agrobacterium transformação mediada, permitindo a expressão de trânsito de proteínas de fusão. A reconstituição do sinal YFP só ocorre quando as proteínas interagem inquérito 1-7. Para testar e validar as interações proteína-proteína, BiFC pode ser usado junto com o fermento dois híbridos do ensaio (Y2H). Isto pode detectar interações indiretas que podem ser negligenciados no Y2H. Tecnologia de gateway é uma plataforma universal que permite aos pesquisadores shuttle o gene de interesse (GOI) em como expressão e muitos sistemas de análise funcional como 8,9 possível. Tanto a orientação do quadro de leitura e pode ser mantido sem o uso de enzimas de restrição ou ligadura de fazer-expressão pronto clones. Como resultado, pode-se eliminar todas as etapas de re-seqüenciamento para garantir resultados consistentes ao longo dos experimentos. Nós criamos uma série de vetores gateway compatível BiFC e Y2H que fornecer aos pesquisadores, com um fácil de usar ferramentas para executar ensaios tanto BiFC e Y2H 10. Aqui, demonstramos a facilidade de usar o nosso sistema BiFC para testar interações proteína-proteína em N. plantas benthamiana.
Protocol
Discussion
Ensaio BiFC é uma ferramenta poderosa para estudar interações protéicas. Ao contrário do ensaio Y2H tradicional, BiFC não só permite a visualização de interações proteína-proteína, mas também fornece mais informações do complexo de proteínas, como sub-celular de localização. Além disso, é possível detectar interações indiretas, desde que as duas proteínas candidato pode ser trazido perto o suficiente por um terceiro parceiro. Como qualquer tecnologia, BiFC tem suas limitações. Devido a necessi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Vi Nguyen para a leitura do manuscrito e assistência de laboratório em geral.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 |
| MES hydrate | Sigma | M2933 |
| 1 mL slip-tip tuberculin syringe | BD | 309602 |
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