Détection des interactions des protéines dans les plantes en utilisant une passerelle de complémentation par fluorescence bimoléculaire Compatible (BiFC) Système
Summary
Nous avons développé une technique pour tester les interactions entre protéines dans les plantes. Une protéine fluorescente jaune (YFP) est divisée en deux fragments non-cumul. Chaque fragment est clone dans leur cadre d'un gène d'intérêt par l'intermédiaire du système de passerelle, permettant l'expression de protéines de fusion. Reconstitution du signal YFP ne survient que lorsque les protéines interagissent l'enquête.
Abstract
Nous avons développé une technique BiFC pour tester l'interaction entre deux protéines in vivo. Ceci est accompli par fractionnement d'une protéine fluorescente jaune (YFP) en deux fragments non-cumul. Chaque fragment est clone dans leur cadre d'un gène d'intérêt. Ces constructions peuvent alors être co-transformé en Nicotiana benthamiana par transformation Agrobacterium, permettant l'expression de protéines de fusion de transit. La reconstitution du signal YFP ne survient que lorsque les protéines interagissent l'enquête 1-7. Pour tester et valider les interactions protéine-protéine, BiFC peut être utilisé avec deux hybrides de levure (Y2H) dosage. Ceci peut détecter les interactions indirectes qui peuvent être négligés dans le Y2H. La technologie Gateway est une plate-forme universelle qui permet aux chercheurs de faire la navette le gène d'intérêt (GOI) en tant qu'expression de nombreux systèmes et l'analyse fonctionnelle que 8,9 possible. Tant l'orientation et de cadre de lecture peut être maintenue sans l'aide d'enzymes de restriction ou la ligature de rendre l'expression prêts clones. En conséquence, on peut éliminer toutes les étapes de re-séquençage à assurer des résultats constants au cours des expériences. Nous avons créé une série de vecteurs et de la passerelle BiFC Y2H compatibles qui permettent aux chercheurs facile à utiliser des outils pour effectuer des essais et des deux BiFC Y2H 10. Ici, nous démontrons la facilité d'utilisation de notre système BiFC de tester les interactions entre protéines dans N. benthamiana.
Protocol
Discussion
Test BiFC est un outil puissant pour étudier les interactions entre protéines. Contrairement à l'analyse traditionnelle Y2H, BiFC non seulement permet la visualisation des interactions protéine-protéine, mais fournit également plus d'informations sur le complexe protéique, comme localisation sub-cellulaire. En outre, il est possible de détecter des interactions indirectes tant que les deux protéines candidat peut être amené suffisamment près par un troisième partenaire. Comme toute technologie, BiFC…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Vi Nguyen pour la lecture du manuscrit et de l'assistance du laboratoire général.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 |
| MES hydrate | Sigma | M2933 |
| 1 mL slip-tip tuberculin syringe | BD | 309602 |
References
- Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).
- Fang, Y., Spector, D. L. BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions. Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).
- Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).
- Hiatt, S. M. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45, 185-191 (2008).
- Barnard, E. Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast. Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nature. 1, 1278-1286 (2006).
- Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis. Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).
- Earley, K. W. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. The Plant journal : for cell and molecular biology. 45, 616-629 (2006).
- Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends in Plant Science. 7, 193-195 (2002).
- Lu, Q. Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin. The Plant journal : for cell and molecular biology. 61, 259-270 (2010).
- Sparkes, I. A. transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants. Nature protocols. 1, 2019-2025 (2006).
- Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).
- Demidov, V. V. Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature. 3, 1693-1702 (2008).
