Ağ Geçidi Uyumlu Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) kullanarak Bitki Protein Etkileşimleri Tespiti
Summary
Biz bitki protein-protein etkileşimleri test etmek için bir teknik geliştirdik. Sarı floresan protein (YFP) örtüşmeyen iki parça halinde bölünmüş durumda. Her parçası füzyon proteinleri ifade sağlayan, Gateway sistemi üzerinden ilgi bir gen-frame klonlanmış. YFP sinyal Sulandırma sadece tahkikat proteinler etkileşime girdiğinde oluşur.
Abstract
Biz, in vivo olarak iki protein arasındaki etkileşimi test etmek için bir BiFC tekniği geliştirdik . Bu örtüşmeyen iki parçalara bölme sarı floresan protein (YFP) tarafından gerçekleştirilir. Her parçası ilgi bir gen-frame klonlanmış. Bu yapılardan sonra, füzyon proteinleri transit ifade izin Agrobacterium aracılı dönüşüm yoluyla Nicotiana benthamiana içine ortak dönüştürülmüş olabilir. YFP sinyal sulandırıldıktan sadece tahkikat proteinleri 1-7 etkileşime girdiğinde oluşur. BiFC protein-protein etkileşimleri test etmek ve doğrulamak için, maya iki hibrid (Y2H) tayini ile birlikte kullanıldığında olabilir. Bu Y2H göz ardı edilebilir dolaylı etkileşimleri algılayabilir. Ağ Geçidi teknoloji, servis ilgi gen (GOI) araştırmacıları, evrensel bir platformda pek çok ifade ve mümkün 8,9 olarak fonksiyonel analiz sistemleri. Her iki yönelim ve okuma çerçevesini ifade hazır klonları yapmak için restriksiyon enzimleri veya ligasyonu kullanmadan muhafaza edilebilir. Sonuç olarak, bir deneyler boyunca tutarlı sonuçları elde etmek için yeniden sıralama adımları ortadan kaldırabilir. Biz, hem de BiFC ve Y2H testleri gerçekleştirmek için 10 kolay kullanımlı araçları ile araştırmacılara Ağ Geçidi uyumlu BiFC ve Y2H vektörler bir dizi oluşturduk . Burada, N. protein-protein etkileşimleri test etmek için BiFC sistemini kullanarak kolaylığı göstermek benthamiana bitkiler.
Protocol
Discussion
BiFC tahlil protein etkileşimleri çalışmak için güçlü bir araçtır. BiFC geleneksel Y2H testinin aksine, sadece protein-protein etkileşimleri görselleştirme sağlar, ama aynı zamanda alt hücresel yerleşimi gibi protein kompleksi daha fazla bilgi sağlar. Ayrıca, iki aday proteinler üçüncü bir ortağı tarafından yeterince yakın getirilebilir olarak sürece dolaylı etkileşimleri tespit etmek mümkündür. Herhangi bir teknoloji gibi, BiFC sınırlamaları vardır. BiFC fluorofor oluşumu için mol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi Nguyen Biz el yazması ve genel laboratuvar yardım okuma için teşekkür ederim.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 |
| MES hydrate | Sigma | M2933 |
| 1 mL slip-tip tuberculin syringe | BD | 309602 |
References
- Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).
- Fang, Y., Spector, D. L. BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions. Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).
- Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).
- Hiatt, S. M. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45, 185-191 (2008).
- Barnard, E. Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast. Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nature. 1, 1278-1286 (2006).
- Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis. Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).
- Earley, K. W. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. The Plant journal : for cell and molecular biology. 45, 616-629 (2006).
- Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends in Plant Science. 7, 193-195 (2002).
- Lu, Q. Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin. The Plant journal : for cell and molecular biology. 61, 259-270 (2010).
- Sparkes, I. A. transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants. Nature protocols. 1, 2019-2025 (2006).
- Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).
- Demidov, V. V. Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature. 3, 1693-1702 (2008).
