Обнаружение белковых взаимодействий в завод использованием шлюза Совместимость комплементации флуоресценции Бимолекулярные (BiFC) Системные
Summary
Мы разработали методику для тестирования белок-белковых взаимодействий в растение. Желтый флуоресцентный белок (YFP) расщепляется на два непересекающихся фрагментов. Каждый фрагмент клонировали в рамке интересующего гена через шлюз системы, что позволяет выражение плавления белков. Восстановление сигнала YFP только тогда, когда следствие белки взаимодействуют.
Abstract
Мы разработали BiFC технику для проверки взаимодействия двух белков в естественных условиях. Это достигается за счет расщепления желтый флуоресцентный белок (YFP) на два непересекающихся фрагментов. Каждый фрагмент клонировали в рамке гена. Эти конструкции могут быть совместно преобразован в Nicotiana benthamiana через преобразование опосредованной Agrobacterium, что позволяет транзитным выражение плавления белков. Восстановление сигнала YFP только тогда, когда следствие белки взаимодействуют 1-7. Для проверки и подтверждения белок-белковых взаимодействий, BiFC могут быть использованы вместе с дрожжами два гибридных (Y2H) анализа. Это может обнаружить косвенные взаимодействия, которые могут быть пропущены в Y2H. Шлюз технология является универсальной платформой, которая позволяет исследователям трансфер интересующего гена (ГОИ) на столько экспрессии и функциональные системы анализа в качестве возможных 8,9. Обе ориентации и рамки считывания может быть обеспечена без использования ферментов рестрикции или лигирования, чтобы выражения готовых клонов. В результате, один может устранить все заново последовательность шагов для обеспечения последовательного результаты на протяжении всего эксперимента. Мы создали серию шлюзов совместимы векторов BiFC и Y2H которые предоставляют исследователям с помощью простых в использовании инструментов для выполнения как BiFC и Y2H анализов 10. Здесь мы демонстрируем, простота использования наших BiFC комплекс для тестирования белок-белковых взаимодействий в Н. benthamiana растений.
Protocol
Discussion
BiFC анализ является мощным инструментом для изучения белковых взаимодействий. В отличие от традиционного анализа Y2H, BiFC не только позволяет визуализировать белок-белковых взаимодействий, но также предоставляет дополнительную информацию из белкового комплекса, таких как субклеточные …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны В. И. Нгуен за чтение рукописи и общую помощь лаборатории.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 |
| MES hydrate | Sigma | M2933 |
| 1 mL slip-tip tuberculin syringe | BD | 309602 |
References
- Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).
- Fang, Y., Spector, D. L. BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions. Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).
- Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).
- Hiatt, S. M. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45, 185-191 (2008).
- Barnard, E. Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast. Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nature. 1, 1278-1286 (2006).
- Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis. Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).
- Earley, K. W. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. The Plant journal : for cell and molecular biology. 45, 616-629 (2006).
- Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends in Plant Science. 7, 193-195 (2002).
- Lu, Q. Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin. The Plant journal : for cell and molecular biology. 61, 259-270 (2010).
- Sparkes, I. A. transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants. Nature protocols. 1, 2019-2025 (2006).
- Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).
- Demidov, V. V. Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature. 3, 1693-1702 (2008).
