게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출
Summary
우리는 공장에서 단백질 – 단백질 상호 작용을 테스트하는 기술을 개발했습니다. 노란색 형광 단백질 (YFP은) 2 비 중복 조각으로 분할합니다. 각 조각은 융합 단백질의 표현을 활성화, 게이트웨이 시스템을 통해 관심의 유전자에 프레임에 복제됩니다. 심리 단백질이 상호 작용을 때 YFP 신호의 Reconstitution에만 발생합니다.
Abstract
우리는 생체내 두 단백질 사이의 상호 작용을 테스트하는 BiFC 기술을 개발했습니다. 이 두 아닌 중복 조각으로 분할 노란색 형광 단백질 (YFP를)에 의해 수행됩니다. 각 조각은 관심의 유전자에 프레임에 복제됩니다. 이러한 구성은 다음 융합 단백질의 통과 식을 수 있도록 Agrobacterium의 중재 변환을 통해 Nicotiana benthamiana에 공동 변형하실 수 있습니다. 심리 단백질은 1-7을 상호 작용을 때 YFP 신호의 reconstitution에만 발생합니다. 단백질 단백질 상호 작용을 테스트하고 유효성을 검사하려면 BiFC는 효모 두 하이브리드 (Y2H) 분석과 함께 사용할 수 있습니다. 이것은 Y2H에서 간과된 수있는 간접적인 상호 작용을 검색할 수 있습니다. 게이트웨이 기술에 관심 셔틀의 유전자를 (GOI)에 연구자 수있는 범용 플랫폼입니다 많은 표현 가능한 8,9와 같은 기능 분석 시스템과 같은. 오리 엔테이션 및 읽기 프레임 모두 표현 가능한 클론을 만들기 위해 제한 효소 또는 결합을 사용하지 않고 유지하실 수 있습니다. 그 결과, 하나는 실험을 통해 일관성있는 결과를 보장하기 위해 모든 다시 시퀀싱 단계를 제거할 수 있습니다. 우리는 BiFC와 Y2H 모두 assays 10을 수행하기 위해 사용하기 쉬운 도구를 통해 연구자를 제공 게이트웨이 호환 BiFC 및 Y2H 벡터 일련의를 만들었습니다. 여기, 우리는 N.에 단백질 단백질 상호 작용을 테스트하기 위해 BiFC 시스템을 사용의 용이성을 보여주 benthamiana 식물.
Protocol
Discussion
BiFC 분석은 단백질 상호 작용을 공부를위한 강력한 도구입니다. 전통 Y2H 분석과는 달리, BiFC뿐만 아니라 단백질 단백질 상호 작용의 시각화을 허용뿐만 아니라 하위 세포 지방화 같은 단백질 복잡한 더 많은 정보를 제공합니다. 또한, 그것은 두 후보 단백질이 세번째 파트너 가까이에 충분히 가져 수있는만큼 간접적인 상호 작용을 검출하는 것이 가능합니다. 모든 기술과 마찬가지로, BiFC는 제한 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고와 일반적인 실험실 지원을 읽을 바이올렛 Nguyen 감사합니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 |
| MES hydrate | Sigma | M2933 |
| 1 mL slip-tip tuberculin syringe | BD | 309602 |
References
- Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).
- Fang, Y., Spector, D. L. BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions. Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).
- Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).
- Hiatt, S. M. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45, 185-191 (2008).
- Barnard, E. Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast. Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nature. 1, 1278-1286 (2006).
- Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis. Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).
- Earley, K. W. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. The Plant journal : for cell and molecular biology. 45, 616-629 (2006).
- Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends in Plant Science. 7, 193-195 (2002).
- Lu, Q. Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin. The Plant journal : for cell and molecular biology. 61, 259-270 (2010).
- Sparkes, I. A. transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants. Nature protocols. 1, 2019-2025 (2006).
- Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).
- Demidov, V. V. Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature. 3, 1693-1702 (2008).
