Detectie van eiwit interacties in Plant met behulp van een Gateway-compatibele Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) Systeem
Summary
We hebben een techniek ontwikkeld om eiwit-eiwit interacties in planten te testen. Een geel fluorescerend eiwit (YFP) wordt opgesplitst in twee niet-overlappende fragmenten. Elk fragment is gekloond in-frame aan een gen van belang via de Gateway-systeem, waardoor de expressie van fusie-eiwitten. Reconstitutie van YFP-signaal treedt alleen op wanneer de lijkschouwing eiwitten met elkaar omgaan.
Abstract
We hebben een BiFC techniek om de interactie tussen twee eiwitten in vivo testen. Dit wordt bereikt door het splitsen van een geel fluorescerend eiwit (YFP) in twee niet-overlappende fragmenten. Elk fragment is gekloond in-frame aan een gen van interesse. Deze constructen kunnen vervolgens worden omgezet in co-Nicotiana benthamiana via Agrobacterium gemedieerde transformatie, waardoor de doorvoer expressie van fusie-eiwitten. De reconstructie van YFP-signaal treedt alleen op wanneer de lijkschouwing eiwitten interageren 1-7. Voor het testen en valideren van de eiwit-eiwit interacties, kunnen BiFC worden gebruikt in combinatie met de gist twee-hybride (Y2H) test. Dit kan detecteren indirecte interacties die kunnen worden over het hoofd gezien in de Y2H. Gateway-technologie is een universeel platform dat onderzoekers in staat stelt om de pendelbus van het gen van belang (GOI) in zoveel expressie en functionele analyse systemen mogelijk 8,9. Zowel de oriëntatie en het lezen van frame kan worden onderhouden zonder gebruik te maken van restrictie-enzymen of ligatie tot uitdrukking-ready klonen te maken. Als gevolg daarvan kan men elimineren van alle re-sequencing stappen om consistente resultaten in de gehele experimenten. We hebben een reeks van Gateway compatibele BiFC en Y2H vectoren die onderzoekers met eenvoudig te gebruiken tools om zowel BiFC en Y2H assays 10. Hier laten we zien het gemak van het gebruik van onze BiFC systeem om eiwit-eiwit interacties in N.-test benthamiana planten.
Protocol
Discussion
BiFC assay is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van eiwit interacties. In tegenstelling tot de traditionele Y2H test, BiFC kunnen niet alleen de visualisatie van eiwit-eiwit interacties, maar geeft ook meer informatie van het eiwitcomplex, zoals sub-cellulaire lokalisatie. Ook is het mogelijk om indirecte interacties te detecteren zo lang als de twee kandidaat-eiwitten kan dichtbij genoeg worden gebracht door een derde partner. Net zoals elke technologie, BiFC heeft zijn beperkingen. Als gevolg van de eis van …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Vi Nguyen voor het lezen van het manuscript en de algemene lab hulp.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 |
| MES hydrate | Sigma | M2933 |
| 1 mL slip-tip tuberculin syringe | BD | 309602 |
References
- Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).
- Fang, Y., Spector, D. L. BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions. Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).
- Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).
- Hiatt, S. M. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45, 185-191 (2008).
- Barnard, E. Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast. Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nature. 1, 1278-1286 (2006).
- Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis. Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).
- Earley, K. W. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. The Plant journal : for cell and molecular biology. 45, 616-629 (2006).
- Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends in Plant Science. 7, 193-195 (2002).
- Lu, Q. Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin. The Plant journal : for cell and molecular biology. 61, 259-270 (2010).
- Sparkes, I. A. transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants. Nature protocols. 1, 2019-2025 (2006).
- Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).
- Demidov, V. V. Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature. 3, 1693-1702 (2008).
