MALDI-TOF massespektrometri blev succesfuldt udnyttet til at overvåge amid hydrogen / deuterium udveksling i protein kinase Pak2 aktivering.
Amid hydrogen / deuterium udveksling (H / D udveksling) kombineret med massespektrometri er blevet brugt til at analysere grænsefladen af protein-protein interaktioner, protein konformationelle ændringer, protein dynamik og protein-ligand interaktioner. H / D udveksling på rygraden amid stillinger er blevet anvendt til at måle deuteration satserne for de mikro-regioner i et protein massespektrometri 1,2,3. Løsningen af denne metode afhænger af pepsin fordøjelse af deutereret protein af interesse i peptider, der normalt interval fra 3 til 20 rester. Selv om løsningen af H / D udveksling målt ved massespektrometri er lavere end en enkelt restkoncentration opløsning målt ved Heteronuclear Single kvantekohærens (HSQC) metode af NMR, de massespektrometri måling i H / D Børs er ikke begrænset af størrelsen af protein 4. H / D udveksling er udført i en vandig opløsning, som fastholder protein kropsbygning. Vi tilbyder en metode, der utilizes MALDI-TOF til påvisning 2, i stedet for en HPLC / ESI (electrospray ionisering)-MS-system 5,6. MALDI-TOF giver præcise masse intensitet data til peptider af fordøjet protein, i dette tilfælde protein kinase Pak2 (også kaldet γ-Pak). Proteolyse af Pak 2 er udført i en offline pepsin fordøjelsen. Denne alternative metode, når brugeren ikke har adgang til en HPLC og pepsin kolonne forbundet med massespektrometri, eller når pepsin kolonne på HPLC ikke resultere i en optimal fordøjelse kort, for eksempel, den stærkt disulfid-bonded udskilles fosfolipase A 2 (SPLA 2). Ved hjælp af denne metode, vi med succes overvåges ændringer i deuteration niveau i aktivering af Pak2 ved caspase 3 spaltning og autophosphorylation 7,8,9.
Identifikation af Pepsin-resumé Fragmenter er et kritisk trin i H / D udveksling eksperiment. Ukorrekt identifikation af peptid kan føre til en forkert konklusion. Pepsin-fordøjet Pak2 elueres gennem en omvendt fase HPLC C18 kolonne for at opnå en ren baggrund. I vores eksperimenter, var i alt 40 fraktioner indsamlet og udsat for MALDI-TOF. Flere peptider kunne identificeres i de enkelte fraktioner. De peptider blev udsat for tandem massespektrometri (Q-TOF MS / MS og oMALDI MS / MS) for at identificere deres sekvenser. MS / MS spektre af et peptid skal have mindst tre produkt-ioner til at bekræfte identifikationen af peptid.
Data Explorer 4.0 edb-program (Applied Biosystems) udfører den indledende baseline korrektion og støj filtrering. Hvert spektrum skal kalibreres baseret på to sekventeret toppe. Vi kalibrerer vores spektrum af teoretiske masse af undeuterated m / z, som er 923,45 og 1697,84. THan masse nøjagtighed efter kalibrering kan nå op på 10 ppm. Ved deuteration, kan mono-isotop skift til et højere masse. Enhedsstat skridt stiger til disse m / z nøgletal gav de forbedrede masserne er forbundet med deuteration. De højeste intensiteter af massen kuvert vil ikke påvirke deuteration niveau. Men peak intensiteten af den isotopiske toppe i et bestemt masse konvolut er afgørende for beregningen af den gennemsnitlige masse. Det første skridt i beregningen af de indbyggede deuteron er at trække peptid masse af ikke-deutereret prøve fra deutereret prøven. Tre andre faktorer, D 2 O fortynding, det resterende deuteroner i sidekæder og ryggen udveksling, vil skulle overvejes yderligere i beregningen (Figur 1). D 2 O er den fortynding faktor D 2 O efter blanding af prøven og D 2 O buffer at indlede H / D udveksling. De resterende deuteron (4,5%) i sidekæder af pepsinet-digested peptider skal fratrækkes. Den back-udveksling er det uundgåelige tab af deuteration i alle deutereret og pepsin-fordøjet peptider i massen måleprocessen.
Den mest solvente tilgængelige peptid (m / z = 1105,60) efter 24-time H / D udveksling repræsenterer en fuld deuteration region. Den indbyggede deuteron nummer for hver af peptider er forskellen mellem det geometriske tyngdepunkt af de deutereret og ikke-deutereret Pak2 peptisk peptider. Den mest deutereret peptid m / z 1105 blev valgt til at repræsentere fuld deuteration når Pak2 var på 24 timer i H / D udveksling. Back Exchange Ratio blev beregnet af det faktiske indarbejdet deuteron antal på 24 timer i H / D udveksling divideret med alle mulige udskiftelige websteder på peptid m / z 1105.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er delvist understøttet fra National Institutes of Health Grant GM-26738 (til JAT).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
D2O | Aldrich | 7789-20-0 | |
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | 28166-41-8 | |
MALDI-TOF | PE Biosystems | Voyager DE STR | |
Q-TOF mass spectrometer | Q-TOF Ultima-Global | ||
QSTAR XL oMALDI MS/MS | Applied Biosystems | ||
Data Explorer 4.0 computer program | Applied Biosystems |