MALDI-TOF масс-спектрометрии была успешно использована для контроля амид водород / дейтерий обмена белка активации киназы Pak2.
Амид водород / дейтерий обмена (H / D обмена) в сочетании с масс-спектрометрии широко используется для анализа интерфейс белок-белковых взаимодействий, белка конформационные изменения, динамики белков и белок-лиганд. H / D обмена на позиции позвоночник амид был использован для измерения дейтерирования темпы микро-регионов белка методом масс-спектрометрии 1,2,3. Разрешение этого метода зависит от пепсина переваривания дейтерированных белок на пептиды, которые обычно в диапазоне от 3-20 остатков. Хотя разрешение H / D обмена измеряется методом масс-спектрометрии ниже, чем одной резолюции остаток измеряется Гетероядерные одиночной квантовой когерентности (HSQC) методом ЯМР, масс-спектрометрия измерения в H / D обмена не ограничен размер белок 4. H / D обмена осуществляется в водном растворе, который поддерживает конформации белка. Мы предлагаем метод, который Utilхарактеризует MALDI-TOF для обнаружения 2, вместо того, чтобы HPLC / ESI (электрораспылением ионизации)-системы MS 5,6. MALDI-TOF обеспечивает получение точных данных интенсивности массы для пептиды усваиваются белки, в этом случае протеинкиназы Pak2 (также называется γ-Pak). Протеолиз Пак 2 проводится в автономном пищеварения пепсина. Этот альтернативный метод, когда пользователь не имеет доступа к высокоэффективной жидкостной хроматографии и пепсина колонки подключены к масс-спектрометрия, или когда пепсина колонке HPLC не приводит к оптимальным карте пищеварения, например, сильно дисульфидными связями выделяются фосфолипазы 2 (SPLA 2). Используя этот метод, мы успешно мониторинг изменений в дейтерирования уровне во время активации Pak2 по каспазы 3 расщепления и аутофосфорилирования 7,8,9.
Определение Пепсин-дайджестом Фрагменты является важным шагом в H / D эксперимент обмена. Неправильная идентификация пептида может привести к неправильному выводу. Пепсин-переваренной Pak2 вымывается через обратный ВЭЖХ C18 колонке для получения чистой фона. В наших экспериментах в общей сложности 40 фракций были собраны и подвергнуты MALDI-TOF. Несколько пептиды могут быть определены в каждой из фракций. Пептиды были подвергнуты тандемной масс-спектрометрии (Q-TOF MS / MS и oMALDI MS / MS) для определения их последовательности. MS / MS спектры пептида должны иметь не менее трех ионов продукт для подтверждения идентификации пептида.
Данные Explorer 4.0 Компьютерная программа (Applied Biosystems) выполняет начальную коррекция базовой линии и фильтрации шума. Каждый спектр должен быть откалиброван на базе двух последовательных пиков. Мы калибровку наших спектра теоретическая масса undeuterated т / г, которые 923,45 и 1697,84. ТОн массы точность после калибровки может достигать 10 частей на миллион. По дейтерирования, моно-изотопов могут перейти на более высокую массу. Унитарное увеличивает шаг к этим т / г соотношение дали расширенной масс связано с дейтерирования. Пик интенсивности массы конверте не повлияет дейтерирования уровне. Тем не менее, пик интенсивности изотопных пиков в частности массы оболочки имеют решающее значение для расчета средней массы. Первый шаг расчет включены дейтрона вычитания пептид массой, не дейтерированного образца из дейтерированного образца. Три других факторов, D 2 O разбавления, остаточная дейтронов в боковые цепи и обратно обмена, должны быть дополнительно рассмотрены в расчет (рис. 1). D 2 O разведения коэффициент разбавления D 2 O после смешивания образца и D 2 O буфера инициировать H / D обмена. Остаточные дейтрона (4,5%), в боковых цепей пепсина-дайджестред пептидов необходимо вычесть. Резервное обмен неизбежные потери дейтерирования во всех дейтерированных и пепсина-переваренной пептидов в процессе измерения массы.
Наиболее доступным растворителя пептид (м / г = 1105,60), после 24-часового Н / D обмена представляет собой полный регионе дейтерирования. Включены дейтрона номер для каждого из пептидов представляет собой разницу между центром тяжести дейтерированных и не дейтерированного Pak2 пептидов язвенной. Наиболее дейтерированных пептида т / г 1105 был выбран для представления полной дейтерирования когда Pak2 был в 24 ч H / D обмена. Вернуться коэффициент обмена был рассчитан путем фактического включены дейтрона числа в 24 ч H / D обмена делится на всех возможных сменных сайтов на пептида т / г 1105.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа частично поддержана из Национального института здоровья Грант GM-26738 (к JAT).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
D2O | Aldrich | 7789-20-0 | |
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | 28166-41-8 | |
MALDI-TOF | PE Biosystems | Voyager DE STR | |
Q-TOF mass spectrometer | Q-TOF Ultima-Global | ||
QSTAR XL oMALDI MS/MS | Applied Biosystems | ||
Data Explorer 4.0 computer program | Applied Biosystems |