MALDI-TOF spectrométrie de masse a été utilisé avec succès pour contrôler l'amide d'hydrogène / deutérium de change dans la protéine kinase PAK2 activation.
Amide hydrogène / deutérium échange (échange H / D) couplée à la spectrométrie de masse a été largement utilisée pour analyser l'interface des interactions protéine-protéine, protéine de conformation change, la dynamique des protéines et des interactions protéine-ligand. Échange H / D sur les positions amide épine dorsale a été utilisé pour mesurer le taux de deutération des micro-régions dans une protéine par spectrométrie de masse 1,2,3. La résolution de cette méthode dépend de digestion par la pepsine de la protéine deutérée d'intérêt en peptides qui varient normalement de 3 à 20 résidus. Bien que la résolution de l'échange H / D mesurée par spectrométrie de masse est inférieure à la résolution seul résidu mesuré par le simple hétéronucléaire cohérence quantique (HSQC) méthode de RMN, la spectrométrie de masse en mesure échange H / D n'est pas limité par la taille de la protéines 4. Échange H / D est réalisé dans une solution aqueuse qui maintient la conformation des protéines. Nous fournissons une méthode qui utilIZES l'MALDI-TOF pour la détection de deux, au lieu d'un système HPLC / ESI (ionisation par électrospray)-MS 5,6. Le MALDI-TOF fournit des données précises sur l'intensité de masse pour les peptides de la protéine digérée, dans ce cas la protéine kinase PAK2 (aussi appelée γ-Pak). Protéolyse de Pak 2 est réalisée en une digestion par la pepsine déconnecté. Cette méthode alternative, lorsque l'utilisateur n'a pas accès à une colonne de CLHP et la pepsine connecté à la spectrométrie de masse, ou lorsque la colonne de pepsine sur HPLC ne résulte pas en une carte de digestion optimale, par exemple, le disulfure fortement lié phospholipase A 2 sécrétée (SPLA 2). Utilisant cette méthode, nous avons réussi à surveiller l'évolution du niveau lors de l'activation de la deutération PAK2 par la caspase 3 clivage et l'autophosphorylation 7,8,9.
Identification de la pepsine fragments digérés est une étape critique de l'expérience échange H / D. Identification incorrecte du peptide peut conduire à une conclusion erronée. PAK2 pepsine-digérée est éluée à travers une colonne HPLC phase inverse C18 pour obtenir un fond propre. Dans nos expériences, un total de 40 fractions ont été recueillies et soumises à MALDI-TOF. Peptides multiples pourraient être identifiés dans chacune des fractions. Les peptides ont été soumis à la spectrométrie de masse (Q-TOF MS / MS et oMALDI MS / MS) pour identifier leurs séquences. Les spectres MS / MS d'un peptide devrait avoir au moins trois ions de produit pour confirmer l'identification du peptide.
Le programme Data Explorer 4.0 ordinateur (Applied Biosystems) effectue la correction de base initial et la filtration du bruit. Chaque spectre doit être étalonné sur deux pics séquencé. Nous calibrer notre spectre par la masse théorique de l'undeuterated m / z qui sont 923,45 et 1697,84. TIl précision de la masse après l'étalonnage peut atteindre 10 ppm. Après deutération, les mono-isotopique peut passer à un supérieur de masse. Augmentations d'échelon unitaire de ces rapports m / z donné les masses améliorée associée à deutération. Les intensités maximales de l'enveloppe de masse ne sera pas affecter le niveau de deutération. Toutefois, les intensités des pics des pics isotopiques dans une enveloppe de masse sont particulièrement critiques pour le calcul de la masse moyenne. La première étape du calcul de la deutéron est incorporé soustrayant la masse peptidique de l'échantillon des non-deutérés de l'échantillon deutérié. Trois autres facteurs, la D 2 O de dilution, les deutons résiduelle dans les chaînes latérales et l'échange dos, devra être examiné plus avant dans le calcul (figure 1). La dilution de D 2 O est le facteur de dilution de D 2 O après le mélange de l'échantillon et D 2 O buffer pour initier l'échange H / D. Le deuton résiduelle (4,5%) dans les chaînes latérales de la pepsine digérerpeptides éd doit être soustraite. L'arrière-échange est la perte inévitable de deutération dans tous les peptides deutérés et la pepsine-digérés dans le processus de mesure de masse.
Le peptide le plus accessible au solvant (m / z = 1105,60) après 24 heures d'échange H / D représente une région pleine de deutération. Le nombre deutéron constituée pour chacun des peptides est la différence entre le centroïde des peptides deutérés et non deutérés peptique PAK2. Le plus hautement deutéré peptide m / z 1105 a été choisie pour représenter deutération plein quand PAK2 était à 24 heures de échange H / D. Le ratio d'échange Retour a été calculé par le nombre deutéron incorporé réel à 24 heures de échange H / D divisé par tous les sites possibles échangeables à peptide m / z 1105.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail est soutenu en partie par le National Institutes of Health Grant GM-26738 (à la JAT).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
D2O | Aldrich | 7789-20-0 | |
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | 28166-41-8 | |
MALDI-TOF | PE Biosystems | Voyager DE STR | |
Q-TOF mass spectrometer | Q-TOF Ultima-Global | ||
QSTAR XL oMALDI MS/MS | Applied Biosystems | ||
Data Explorer 4.0 computer program | Applied Biosystems |