MALDI-TOF spettrometria di massa è stato utilizzato con successo per monitorare la amide idrogeno / deuterio in cambio di attivazione della proteina chinasi Pak2.
Ammide idrogeno / deuterio scambio (H / D cambio) accoppiata a spettrometria di massa è stata ampiamente utilizzata per analizzare l'interfaccia di interazioni proteina-proteina, i cambiamenti conformazionali delle proteine, la dinamica delle proteine e le interazioni proteina-ligando. H / D cambio sulle posizioni ammidico la spina dorsale è stata utilizzata per misurare i tassi deuterazione delle micro-regioni di una proteina mediante spettrometria di massa 1,2,3. La risoluzione di questo metodo dipende dalla digestione pepsina deuterati della proteina di interesse in peptidi che normalmente gamma 3-20 residui. Anche se la risoluzione di H / D cambio misurato mediante spettrometria di massa è inferiore alla risoluzione singolo residuo misurata dal eteronucleari singola coerenza quantistica (HSQC) metodo di NMR, la misurazione della spettrometria di massa in H / D cambio non è limitata dalla dimensione del proteine 4. H / D lo scambio avviene in soluzione acquosa che mantiene la conformazione delle proteine. Mettiamo a disposizione un metodo che utilIZES il MALDI-TOF per la rilevazione di 2, al posto di un HPLC / ESI (ionizzazione electrospray)-MS sistema di 5,6. Il MALDI-TOF fornisce dati accurati intensità di massa per i peptidi della proteina digerita, in questo caso Pak2 proteina chinasi (detta anche γ-Pak). Proteolisi di Pak 2 è effettuato in una digestione pepsina non in linea. Questo metodo alternativo, quando l'utente non ha accesso a una colonna HPLC e pepsina collegato alla spettrometria di massa, o quando la colonna pepsina in HPLC non si traduca in una mappa digestione ottimale, per esempio, il pesante disolfuro-bonded secreto fosfolipasi A 2 (SPLA 2). Utilizzando questo metodo, abbiamo monitorato con successo i cambiamenti nel livello deuterazione durante l'attivazione della caspasi 3 Pak2 di scissione e autofosforilazione 7,8,9.
Identificazione della pepsina-digerito Frammenti è un passo fondamentale della H / D esperimento di scambio. Identificazione errata del peptide può condurre a conclusioni errate. Pak2 pepsina-digerito viene eluito in una colonna HPLC in fase inversa C18 per ottenere un fondo pulito. Nei nostri esperimenti, un totale di 40 frazioni sono state raccolte e sottoposte a MALDI-TOF. Peptidi multipli potrebbero essere identificati in ciascuna delle frazioni. I peptidi sono stati sottoposti a spettrometria di massa tandem (Q-TOF MS / MS e oMALDI MS / MS) per identificare le loro sequenze. La MS / MS spettri di un peptide dovrebbe avere almeno tre ioni prodotto per confermare l'identificazione del peptide.
Il programma per computer Data Explorer 4.0 (Applied Biosystems) esegue la correzione iniziale di base e filtraggio del rumore. Ogni spettro deve essere calibrata sulla base di due picchi in sequenza. Noi calibrare il nostro spettro da parte della massa teorica del undeuterated m / z che sono 923,45 e 1697,84. Tlui accuratezza di massa dopo la calibrazione può raggiungere i 10 ppm. Su deuterazione, il mono-isotopo può passare ad una massa maggiore. Aumenta passo unitario a questi m / z rapporti ceduto le masse associate a una maggiore deuterazione. L'intensità dei picchi della busta di massa non influisce sul livello deuterazione. Tuttavia, l'intensità dei picchi dei picchi isotopici in una busta di massa particolare sono fondamentali per il calcolo della massa media. Il primo passo del calcolo del deutone è incorporato sottraendo la massa del peptide non deuterati campione dal campione deuterato. Tre altri fattori, la diluizione D 2 O, il deuteroni residuo nelle catene laterali e il cambio posteriore, dovranno essere ulteriormente considerati nel calcolo (Figura 1). La diluizione D 2 O è il fattore di diluizione D 2 O dopo la miscelazione del campione e D 2 O di buffer di avviare la H / D cambio. Deutone residua (4,5%) nelle catene laterali della pepsina-digerirepeptidi ed ha bisogno di essere sottratto. Il back-scambio è l'inevitabile perdita di deuterazione in tutti i peptidi deuterato e pepsina-digerito nel processo di misura di massa.
Il peptide più accessibile solvente (m / z = 1105,60) dopo 24 ore di H / D cambio rappresenta una regione ricca deuterazione. Il numero deuterone incorporato per ciascuno dei peptidi è la differenza tra il baricentro dei peptidi deuterati e non deuterati peptica Pak2. Il più grande deuterati peptide m / z 1105 è stato selezionato per rappresentare deuterazione piena quando Pak2 era a 24 ore di H / D cambio. Il Rapporto di Cambio posteriore è stato calcolato il numero effettivo deuterone incorporata a 24 ore di H / D cambio divisa per tutti i siti possibili scambiabile a peptide m / z 1105.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è supportato in parte dal National Institutes of Health di Grant GM-26738 (a JAT).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
D2O | Aldrich | 7789-20-0 | |
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | 28166-41-8 | |
MALDI-TOF | PE Biosystems | Voyager DE STR | |
Q-TOF mass spectrometer | Q-TOF Ultima-Global | ||
QSTAR XL oMALDI MS/MS | Applied Biosystems | ||
Data Explorer 4.0 computer program | Applied Biosystems |