MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה נוצל בהצלחה כדי לפקח על חילופי אמיד מימן / דאוטריום בהפעלת חלבון kinase Pak2.
חילופי אמיד מימן / דאוטריום (H / D החליפין) יחד עם ספקטרומטריית מסה כבר בשימוש נרחב על מנת לנתח את הממשק של אינטראקציות בין חלבונים, שינויי קונפורמציה בחלבון, הדינמיקה חלבון וחלבון-אינטראקציות ליגנד. H / D החליפין על עמדות אמיד עמוד השדרה נוצל כדי למדוד את שיעורי deuteration של מיקרו אזורים בחלבון על ידי ספקטרומטריית מסה 1,2,3. הרזולוציה של שיטה זו תלויה העיכול פפסין של החלבון deuterated עניין לתוך פפטידים, כי בדרך כלל בטווח 3-20 שאריות. למרות ההחלטה של H / D חילופי נמדד על ידי ספקטרומטריית מסה נמוכה יותר ברזולוציה שאריות אחד נמדד לפי שיטת Heteronuclear יחיד קוונטית (HSQC) קוהרנטיות של התמ"ג, המדידה ספקטרומטריית מסה ב-H / D החליפין אינו מוגבל על ידי גודל של חלבון 4. H / D החליפין מתבצע בתמיסה מימית אשר שומרת קונפורמציה בחלבון. אנו מספקים שיטה utilizes MALDI-TOF לגילוי 2, במקום HPLC / ESI (יינון electrospray)-MS מערכת 5,6. MALDI-TOF מספק נתונים מדויקים עוצמת המסה של פפטידים של חלבון מתעכל, בכל מקרה זה חלבון קינאז Pak2 (המכונה גם γ-Pak). Proteolysis של 2 פאק מתבצע העיכול פפסין מקוון. זו שיטה חלופית, כאשר המשתמש אין גישה לעמודה HPLC ו עכלן המחובר ספקטרומטריית מסה, או כאשר העמודה עכלן על HPLC אינו תוצאה של המפה לעיכול אופטימלי, למשל, בכבדות דיסולפיד-מלוכדות מופרש phospholipase 2 (SPLA 2). ניצול שיטה זו, אנו מצליחים לעקוב שינויים ברמת deuteration במהלך ההפעלה של Pak2 ידי מחשוף 3 caspase ו autophosphorylation 7,8,9.
זיהוי פפסין-מתעכל שברי הוא שלב קריטי של הניסוי חילופי H / D. זיהוי שגוי של הפפטיד יכול להוביל למסקנה שגויה. Pak2 פפסין, הוא מתעכל eluted דרך טור הפוך שלב HPLC C18 כדי לקבל רקע נקי. בניסויים שלנו, סך של 40 שברים נאספו נתונים MALDI-TOF. פפטידים מרובות ניתן לזהות בכל אחד החלקים. פפטידים היו נתונים טנדם ספקטרומטריית מסה (Q-TOF MS / MS ו oMALDI MS / MS) כדי לזהות רצפים שלהם. ספקטרום MS / MS של פפטיד צריך לפחות שלוש יונים מוצר כדי לאשר את הזיהוי של הפפטיד.
סייר נתוני התוכנית 4.0 המחשב (Applied Biosystems) מבצעת את תיקון הבסיס הראשוני סינון רעש. כל הספקטרום צריך להיות מכויל מבוסס על שתי פסגות רצף. אנו לכייל ספקטרום שלנו על ידי המסה התיאורטית של מ undeuterated / z שהם 923.45 ו – 1697.84. Tהוא דיוק המוני אחרי כיול יכול להגיע 10 עמודים לדקה. עם deuteration, מונו איזוטופ עשוי לעבור מסה גבוהה יותר. מגביר צעד לפירוק היחסים הללו כדי m / z הניב את ההמונים משופרת הקשורים deuteration. עוצמות השיא של המעטפה המונית לא ישפיע על רמת deuteration. עם זאת, עוצמות השיא של פסגות איזוטופי במעטפה מסה מסוימת הם קריטיים לחישוב מסת הממוצע. הצעד הראשון של החישוב של deuteron שולבו היא הפחתת מסת פפטיד של המדגם הלא deuterated מן המדגם deuterated. שלושה גורמים אחרים, דילול D 2 O, deuterons שיורית רשתות לוואי החליפין לאחור, יהיה צורך לשקול נוספת בחישוב (איור 1). דילול 2 O D הוא גורם לדילול של D 2 O לאחר ערבוב המדגם ו-D 2 O חיץ ליזום את H / D החליפין. Deuteron שיורי (4.5%) ב שרשראות צד של עכלן לעיכולפפטידים עורך צריך להיות מופחתים. בחזרה לבורסה הוא אובדן בלתי נמנעת של deuteration בכל פפטידים deuterated ו-עכלן מתעכל בתהליך מדידה המונית.
הפפטיד נגיש ממס ביותר (m / z = 1105.60) אחרי שעה של H-24 / D חילופי מייצג אזור deuteration מלא. מספר deuteron משולבים עבור כל אחד פפטידים ההבדל בין centroid של פפטידים deuterated ולא deuterated פפטי Pak2. הפפטיד ביותר deuterated ביותר מ / z 1105 נבחרה לייצג deuteration מלא כאשר Pak2 היה 24 שעות של H / D החליפין. יחס חליפין חזרה חושבה לפי מספר deuteron בפועל שולבו ב 24 שעות של H / D חילופי מחולק כל האתרים חליפי אפשרי פפטיד m / z 1105.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכת בחלק מן המכונים הלאומיים לבריאות גרנט GM-26738 (אל ג'ת).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
D2O | Aldrich | 7789-20-0 | |
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | 28166-41-8 | |
MALDI-TOF | PE Biosystems | Voyager DE STR | |
Q-TOF mass spectrometer | Q-TOF Ultima-Global | ||
QSTAR XL oMALDI MS/MS | Applied Biosystems | ||
Data Explorer 4.0 computer program | Applied Biosystems |