MALDI-TOF kütle spektrometresi başarıyla protein kinaz Pak2 aktivasyon amid hidrojen / döteryum değişimini izlemek için kullanılmıştır.
Kütle spektrometresi ile birlikte Amid hidrojen / döteryum değişimi (Y / D değişimi), yaygın olarak,, protein-protein etkileşimleri, protein konformasyonel değişiklikler, protein dinamiği ve protein-ligand etkileşimleri arayüz analiz etmek için kullanılır olmuştur. H / D değişimi omurga amid pozisyonları, kütle spektrometresi 1,2,3, bir protein mikro-bölgeler dötertumlanma oranlarını ölçmek için kullanılmıştır. Bu yöntemin çözünürlük normalde 3-20 artıkları aralığı peptidler ilgi döteryumlanmış protein pepsin sindirim bağlıdır. Çözünürlük kütle spektrometresi ile ölçülen H / D değişimi NMR, kütle spektrometresi H / D değişim ölçüm farkı çekirdekli Tek Kuantum Tutarlılık (HSQC) yöntemi ile ölçülen tek kalıntı çözünürlüğü daha düşük olmasına rağmen boyutu ile sınırlı değildir protein 4. H / D değişimi protein konformasyonu korur sulu bir çözelti içinde yürütülmektedir. Biz bir yöntem sağlamak olduğunu utilHPLC / ESI (elektrosprey iyonizasyon)-MS sistemi 5,6 yerine 2 için algılama MALDI-TOF, izes. MALDI-TOF bu durumda protein kinaz Pak2 (γ-Pak da denir), sindirilmiş protein peptidler için doğru kütle yoğunluğu verileri sağlar. Pak 2 Proteoliz bir çevrimdışı pepsinin sindirim gerçekleştirilir. Kullanıcı erişim, kütle spektrometresi bağlı bir HPLC ve pepsin sütun veya HPLC pepsin sütununda, örneğin ağır disülfit gümrüklü salgılanan Fosfolipaz A 2, optimal bir sindirim harita sonucu değildir bulunmamış Bu alternatif bir yöntem, (SPLA 2). Bu yöntemi kullanarak, başarılı kaspaz 3 bölünme ve otofosforilasyon 7,8,9 Pak2 aktivasyonu sırasında dötertumlanma düzeyinde değişiklikler izlenir.
Pepsin özet Fragments Kimlik H / D değişim deney kritik bir adımdır. Peptid yanlış kimlik yanlış bir sonuca yol açabilir. Pepsin-sindirilmiş Pak2 temiz bir arka plan elde etmek için ters faz HPLC C18 kolon ile yıkandı,. Deneylerde, toplam 40 kesirler bir toplandı ve MALDI-TOF tabi. Çoklu peptidler kesirler her tespit olabilir. Peptidler dizileri tanımlamak için tandem kütle spektrometresi (Q-TOF MS / MS ve oMALDI MS / MS) tabi tutuldu. Bir peptit MS / MS spektrumları peptid kimlik doğrulamak için en az üç ürün iyonları olmalıdır.
Data Explorer 4.0 bilgisayar programı (Uygulamalı Biyosistem) ilk temel düzeltme ve gürültü filtreleme yapar. Her spektrumu iki sıralı tepeleri üzerinde göre kalibre edilmelidir. 923,45 ve 1697,84 undeuterated m / z ile teorik kütle spektrumu kalibre edin. To kitle doğruluğu kalibrasyon sonra 10 sayfaya ulaşabilirsiniz. Dötertumlanma üzerine, mono-izotop daha yüksek bir kitle kayabilir. Üniter adım bu m / z oranları artar dötertumlanma ile ilişkili gelişmiş kitlelerin vermiştir. Kitle zarfın pik şiddetleri dötertumlanma düzeyini etkilemez. Ancak, belirli bir kitle zarf içinde izotopik zirvelerinden pik şiddetleri ortalama kütlesinin hesaplanması için kritik öneme sahiptir. Dahil deuteron hesaplama ilk adım döteryumlanmış örneği olmayan döteryumlanmış bir örnek peptid kütle çıkartmaktır. Diğer üç faktör, D 2 O seyreltme, yan zincirleri ve arka döviz kalan deuterons, daha fazla (Şekil 1) hesaplanmasında dikkate alınması gerekir. D 2 O seyreltme sonra D 2 O örnek karıştırma ve D 2 O tampon H / D değişimi başlatmak için seyreltme faktörü. Pepsin-digest yan zincirleri artık deuteron (% 4.5)ed peptidler çıkarılır gerekir. Arka değişim kitle ölçüm sürecinin tüm döteryumlanmış ve pepsin-sindirilmiş peptidler dötertumlanma kaçınılmaz kaybı.
H / D değişimi 24 saat sonra en solvent erişilebilir peptid (m / z = 1105,60) tam bir dötertumlanma bölgede temsil eder. Peptidlerin her biri için dahil deuteron sayısı, döteryumlanmış ve non-döteryumlanmış Pak2 peptik peptidlerin ağırlık merkezi arasındaki farktır. En çok döteryumlanmış peptid m / z 1105 Pak2 H / D değişimi 24 saat iken dötertumlanma temsil etmek üzere seçildi. Geri Alım Satım Oranı peptid m / z 1105 tüm olası değiştirilebilir siteleri tarafından bölünmüş H / D değişimi 24 saat gerçek dahil deuteron sayısına göre hesaplandı.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Hibe GM-26.738 Enstitüleri (JAT) kısmen desteklenmektedir.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
D2O | Aldrich | 7789-20-0 | |
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | 28166-41-8 | |
MALDI-TOF | PE Biosystems | Voyager DE STR | |
Q-TOF mass spectrometer | Q-TOF Ultima-Global | ||
QSTAR XL oMALDI MS/MS | Applied Biosystems | ||
Data Explorer 4.0 computer program | Applied Biosystems |