وقد استخدمت بنجاح MALDI – TOF الطيف الكتلي لرصد الهيدروجين أميد / الديوتيريوم الصرف في بروتين كيناز Pak2 التنشيط.
وقد أميد الهيدروجين / تبادل الديوتيريوم (H / تبادل D) مقرونا المستخدمة على نطاق واسع الطيف الكتلي لتحليل واجهة من البروتين البروتين التفاعلات والتغيرات متعلق بتكوين البروتين ، وديناميات البروتين وتفاعلات البروتين يجند. وقد استخدمت H / D على تبادل المناصب أميد العمود الفقري لقياس معدلات معالجة بالديوتريوم من المناطق الصغيرة في بروتين بواسطة الطيف الكتلي 1،2،3. حل هذا الأسلوب يعتمد على الهضم من البروتين البيبسين deuterated الفائدة في الببتيدات التي تتراوح عادة 3-20 المخلفات. على الرغم من أن القرار من H / D تبادل يقاس الطيف الكتلي هو أقل من واحد بقايا القرار تقاس Heteronuclear الكم طريقة واحدة (HSQC) تماسك الرنين المغناطيسي ، وقياس الطيف الكتلي في H / D الصرف ليس مقيدا حجم 4 البروتين. ويتم H / D الصرف في محلول مائي التي تحافظ على التشكل من البروتين. نحن نقدم طريقة التي UTILizes في MALDI – TOF للكشف 2 ، بدلا من نظام MS – HPLC / ESI (التأين electrospray) 5،6. و- TOF MALDI توفر بيانات دقيقة عن كثافة الشامل للالببتيدات من البروتين المهضوم ، في هذه الحالة بروتين كيناز Pak2 (وتسمى أيضا γ باك). ويتم التحلل البروتيني من باك 2 من أصل في هضم الببسين حاليا. هذه الطريقة البديلة ، وعندما يقوم المستخدم ليس الوصول إلى عمود HPLC والبيبسين متصلة مطياف الكتلة ، أو عندما يكون العمود البيبسين على HPLC لا ينتج مخطط الهضم الأمثل ، وعلى سبيل المثال ، بشدة ثاني كبريتيد العبودي يفرز فسفوليباز A 2 (الجيش الشعبي 2). باستخدام هذا الأسلوب ، ونحن بنجاح رصد التغيرات في مستوى معالجة بالديوتريوم خلال تفعيل Pak2 التي تشطر 3 caspase وautophosphorylation 7،8،9.
التعرف على أجزاء البيبسين – إستفتاء هو خطوة حاسمة لتبادل التجربة H / D. ويمكن تحديد صحيح لالببتيد تؤدي إلى استنتاج خاطئ. هو eluted Pak2 البيبسين هضم من خلال عمود المرحلة HPLC عكس C18 للحصول على خلفية نظيفة. في تجاربنا ، تم جمع ما مجموعه 40 وتعرض لكسور MALDI – TOF. ويمكن تحديد الببتيد متعددة في كل من الكسور. تعرضت الببتيدات إلى جنب الطيف الكتلي (Q – TOF MS / MS وoMALDI MS / MS) لتحديد تسلسل الخاصة بهم. ينبغي للأطياف MS / MS من الببتيد والأيونات المنتج لا يقل عن ثلاثة لتأكيد هوية من الببتيد.
بيانات الكمبيوتر 4.0 مستكشف البرنامج (النظم البيولوجية التطبيقية) بتنفيذ تصحيح الأساس الأولي وترشيح الضوضاء. ويجب معايرة كل الطيف استنادا الى اثنين من قمم متتالية. نحن لدينا من قبل طيف ومعايرة الكتلة النظري للundeuterated م / ض والتي هي 923.45 1697.84. Tيستطيع دقة الشامل بعد معايرة تصل الى 10 جزءا في المليون. عند معالجة بالديوتريوم ، قد أحادي النظائر التحول إلى أعلى الشامل. حققت زيادات خطوة وحدوية لهذه النسب م / ض الجماهير تعزيز المرتبطة معالجة بالديوتريوم. فإن شدة ذروة المغلف الشامل لا تؤثر على مستوى معالجة بالديوتريوم. ومع ذلك ، فإن شدة ذروة الذرى النظائر في ظرف معين كتلة حرجة لحساب كتلة المتوسط. الخطوة الأولى من حساب دوتيرون أدرجت هو طرح كتلة الببتيد من العينة غير deuterated من العينة deuterated. وهناك ثلاثة عوامل أخرى ، في تخفيف D O 2 ، deuterons المتبقية في السلاسل الجانبية وتبادل الظهر ، الحاجة إلى مزيد من النظر في حساب (الشكل 1). التخفيف D O 2 هو عامل إضعاف D 2 O بعد خلط العينة وD O 2 العازلة للشروع في تبادل H / D. ودوتيرون المتبقية (4.5 ٪) في سلاسل جانب البيبسين هضمالببتيدات إد يجب أن يكون مطروح. الجزء الخلفي لتبادل هو خسارة حتمية لمعالجة بالديوتريوم في جميع الببتيدات deuterated وهضم الببسين في كتلة عملية القياس.
ومعظم المذيبات الببتيد الوصول (م / ض = 1105.60) بعد ساعة من H – 24 / D تبادل يمثل معالجة بالديوتريوم المنطقة بالكامل. عدد دوتيرون أدرجت لكل من الببتيدات هو الفرق بين النقطه الوسطى من الببتيدات Pak2 deuterated الهضمية وغير deuterated. تم اختيار معظم الببتيد deuterated جدا م / ض 1105 لتمثيل معالجة بالديوتريوم كامل عندما كان في Pak2 24 ساعة من H / D الصرف. تم احتساب نسبة صرف عودة من العدد الفعلي دوتيرون أدرجت في 24 ساعة من H / D تبادل مقسوما على جميع المواقع المحتملة للصرف في الببتيد م / ض 1105.
The authors have nothing to disclose.
ويدعم هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح GM – 26738 (لجات).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
D2O | Aldrich | 7789-20-0 | |
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | 28166-41-8 | |
MALDI-TOF | PE Biosystems | Voyager DE STR | |
Q-TOF mass spectrometer | Q-TOF Ultima-Global | ||
QSTAR XL oMALDI MS/MS | Applied Biosystems | ||
Data Explorer 4.0 computer program | Applied Biosystems |