MALDI-TOF massaspectrometrie werd met succes gebruikt om de amide waterstof / deuterium uitwisseling in proteïne kinase Pak2 activatie te controleren.
Amide waterstof / deuterium uitwisseling (H / D exchange) gekoppeld aan massaspectrometrie is op grote schaal gebruikt om de interface van eiwit-eiwit interacties, proteïne conformatie verandering, dynamiek en eiwit-eiwit-ligand interacties te analyseren. H / D uit te wisselen over de backbone amide posities is gebruikt om de deuteration tarieven van de micro-regio's in een eiwit te meten door massaspectrometrie 1,2,3. De resolutie van deze methode hangt af van pepsine vertering van de gedeutereerde eiwit van belang in de peptiden die variëren 3-20 residuen. Hoewel de resolutie van de H / D uitwisseling gemeten door middel van massaspectrometrie lager is dan de single residu resolutie gemeten door de heteronucleair Single Quantum Coherence (HSQC) methode van NMR, de massaspectrometrie meting in H / D uitwisseling wordt niet beperkt door de grootte van de eiwit 4. H / D uitwisseling wordt uitgevoerd in een waterige oplossing die eiwitconformatie onderhoudt. Wij bieden een methode die utilizes de MALDI-TOF voor detectie 2, in plaats van een HPLC / ESI (electrospray ionisatie)-MS-systeem 5,6. De MALDI-TOF zorgt voor nauwkeurige massa-intensiteit van gegevens voor de peptiden van de verteerd eiwit, in dit geval proteïne kinase Pak2 (ook wel γ-Pak). Proteolyse van Pak 2 wordt uitgevoerd in een offline pepsine spijsvertering. Deze alternatieve methode, wanneer de gebruiker geen toegang heeft tot een HPLC kolom en pepsine verbonden met massa-spectrometrie, of wanneer de pepsine column op HPLC resulteert niet in een optimale vertering kaart, bijvoorbeeld, de zwaar disulfide-gebonden afgescheiden fosfolipase A 2 hebben (SPLA 2). Gebruik te maken van deze methode hebben we met succes gevolgd veranderingen in het deuteration niveau tijdens activatie van Pak2 door caspase 3 decollete en autofosforylatie 7,8,9.
Identificatie van de pepsine-bundel Fragments is een belangrijke stap van de H / D wisselen experiment. Onjuiste identificatie van de peptide kan leiden tot een verkeerde conclusie. Pepsine-verteerd Pak2 is geëlueerd door middel van een omgekeerde fase HPLC C18 kolom aan een schone achtergrond te verkrijgen. In onze experimenten, werden in totaal 40 fracties verzameld en onderworpen aan MALDI-TOF. Meerdere peptiden konden worden geïdentificeerd in elk van de fracties. De peptiden werden onderworpen aan tandem massaspectrometrie (Q-TOF-MS / MS en oMALDI MS / MS) om hun sequenties te identificeren. De MS / MS spectra van een peptide moeten ten minste drie product-ionen tot de identificatie van de peptide te bevestigen.
De Data Explorer 4.0 computerprogramma (Applied Biosystems) voert de initiële uitgangswaarde correctie en ruis filtratie. Elk spectrum moet worden gekalibreerd op basis van twee opeenvolgende pieken. We kalibreren onze spectrum door de theoretische massa van de undeuterated m / z die 923,45 en 1697,84. Thij nauwkeurigheid van massa's na de kalibratie kan oplopen tot 10 ppm. Bij deuteration, kan de mono-isotoop verschuiving naar een grotere massa. Unitaire stap neemt toe tot deze m / z-verhoudingen leverde de verbeterde massa's verbonden met deuteration. De piek intensiteiten van de massa envelop heeft geen invloed op de deuteration niveau. Echter, de piek intensiteiten van de isotopische pieken in een bepaalde massa envelop zijn van cruciaal belang voor de berekening van de gemiddelde massa. De eerste stap van de berekening van de opgenomen deuteron is het aftrekken van de peptide massa van de niet-gedeutereerde monster uit de gedeutereerde monster. Drie andere factoren, de D 2 O verdunning, de resterende deuteronen in de zijketens en de rug te wisselen, zal verder moeten worden beschouwd in de berekening (figuur 1). De D 2 O is de verdunning van de factor D 2 O na het mengen van het monster en D 2 O buffer naar de H / D-uitwisseling initiëren. De resterende deuteron (4,5%) in de zijketens van de pepsine-digested peptiden dient te worden afgetrokken. De back-uitwisseling is het onvermijdelijke verlies van deuteration in alle gedeutereerd en pepsine-verteerd peptiden in de massa meetproces.
De meest toegankelijke oplosmiddel peptide (m / z = 1105,60) na 24-uur van de H / D wisselen vertegenwoordigt een volledige deuteration regio. De ingebouwde deuteron aantal voor elk van de peptiden is het verschil tussen het zwaartepunt van de gedeutereerde en niet-gedeutereerde Pak2 ulcus peptiden. De meest gedeutereerde peptide m / z 1105 werd geselecteerd om volledige deuteration te vertegenwoordigen bij Pak2 was op 24 uur van de H / D wisselen. The Back Exchange Ratio is berekend door de werkelijke opgenomen deuteron aantal op 24 uur van de H / D wisselen, gedeeld door alle mogelijke verwisselbare sites op peptide m / z 1105.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt ondersteund in een deel van de National Institutes of Health Grant GM-26738 (tot JAT).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
D2O | Aldrich | 7789-20-0 | |
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | 28166-41-8 | |
MALDI-TOF | PE Biosystems | Voyager DE STR | |
Q-TOF mass spectrometer | Q-TOF Ultima-Global | ||
QSTAR XL oMALDI MS/MS | Applied Biosystems | ||
Data Explorer 4.0 computer program | Applied Biosystems |