موقع محدد الهندسة الكروموسوم البكتيري: ΦC31 كاسيت الموفقة تبادل Integrase (IMCE)
Summary
ووصف طريقة سريعة وفعالة لدمج الحمض النووي الأجنبية ذات الاهتمام إلى سلالات متقبل مسبقة الصنع، ووصف سلالات مهبط،. أسلوب يسمح للموقع المحدد التكامل من شريط الحمض النووي في مكان الهبوط وسادة هندسيا من سلالة معينة، من خلال تصريف الافعال والتعبير عن integrase ΦC31.
Abstract
ويمكن استخدام الكروموسوم البكتيري للحفاظ على ستابلي الحمض النووي الأجنبية في نطاق الضخمة قاعدة 1. الاندماج في كروموسوم تلتف حول قضايا من قبيل التكرار البلازميد والاستقرار البلازميد، عدم التوافق البلازميد، والبلازميد التباين في عدد النسخ. هذا الأسلوب يستخدم integrase في مواقع محددة من بالعاثية المتسلسلة (Φ) C31 2،3. وintegrase ΦC31 يحفز إعادة التركيب مباشرة بين موقعين DNA محددة: attB وattP (34 و BP 39، على التوالي) 4. هذا التوحد هو مستقر ولا تعود 5. A "مهبط" (LP) التي تتكون من تسلسل الجين سبكتينوميسين للمقاومة، aadA (SPR)، وهاء في تم دمج القولونية ß غلوكورونيداز الجين (uidA) يحيط بها مواقع attP في صبغيات meliloti Sinorhizobium، anthropi Ochrobactrum، والأجرعية المورمة في المنطقة بين الجينات، وأناPC مكان، ومكان تيتا، على التوالي. س. ويستخدم meliloti في هذا البروتوكول. كما تم ناقلات المانحة للتعبئة التي تحتوي على مواقع attB المرافقة أحمر فلوري ستوفير بروتين (RFP) الجينات والجينات المقاومة للمضادات الحيوية التي شيدت. في هذا المثال يتم استخدام الجنتاميسين pJH110 البلازميد المقاوم. قد يتم استبدال الجين RFP 6 مع تأنشا المطلوب باستخدام SPH أنا أولا والباسيفيكي بدلا من ذلك قد تأنشا الاصطناعية يحيط بها مواقع attB تكون شبه مستنسخ في ناقلات للتعبئة مثل pK19mob 7. هو الدافع وراء التعبير عن الجينات integrase ΦC31 (المستنسخة من pHS62 8) من قبل مروج أمريكا اللاتينية والكاريبي، على نطاق واسع المضيفة للتعبئة البلازميد pRK7813 9.
ويستخدم بروتوكول التزاوج tetraparental لنقل كاسيت المانحة إلى سلالة ليرة لبنانية وبذلك يحل محل علامات في تسلسل ليرة لبنانية مع كاسيت المانحة. هذه الخلايا هي ترانS-integrants. وتتشكل عبر integrants مع كفاءة نموذجي من 0.5٪. وتوجد عادة عبر integrants ضمن المستعمرات 500-1،000 1 فحص الحساسية للمضادات الحيوية أو بواسطة فحص الأزرق والأبيض باستخدام 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl بيتا-D-حمض الغلوكورونيك (X-الحلاوة). هذا البروتوكول يتضمن إجراءات التزاوج واختيار لخلق وعزل عبر integrants.
Protocol
Discussion
تقنية IMCE يسمح التكامل الفعال للشريط الحمض النووي واحد attB يحيط في المكان، ليرة لبنانية من سلالة هندسيا سابقا. بمجرد أن يتم استنساخ التصور المطلوب بدلا من طلب تقديم العروض لإنشاء كاسيت المانحة، وهذه التقنية لا تتطلب اللاحقة تنقية الحمض النووي، وتحول، مما يج?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
لسميث CM مارجريت لتوفير يرجى استنساخ integrase
بتمويل من:
الجينوم كندا / الجينوم المرج
NSERC اكتشاف ومنح المشروع الاستراتيجي
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Streptomycin | Bioshop Canada Inc. | STP101 | |
| Spectinomycin | Bioshop Canada Inc. | SPE201 | |
| Gentamicin | Bioshop Canada Inc. | GTA202 | |
| Choramphenicol | Bioshop Canada Inc. | CLR201 | |
| Tetracycline | Bioshop Canada Inc. | TET701 | |
| Kanamycin | Bioshop Canada Inc. | KAN201 | |
| Bacteriological grade agar | Bioshop Canada Inc. | AGR001 | |
| Tryptone | Bioshop Canada Inc. | TRP402 | |
| Yeast Extract | Bioshop Canada Inc. | YEX401 | |
| Sodium Chloride | Bioshop Canada Inc. | SOD001 | |
| Calcium Chloride | Bioshop Canada Inc. | CCL444 | |
| X-gluc | Gold Biotechnology Inc. | G1281C1 | |
| E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
| E. coli pJC2 strain | In house, available by request | ||
| E. coli pJH110 strain | In house, available by request | ||
| SmUW227 strain | In house, available by request |
References
- Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).
- Kushtoss, S., Rao, R. N. Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31. J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).
- Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. Serine recombinases as tools for genome engineering. Methods. 53, 372-379 (2011).
- Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).
- Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination. Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).
- Campbell, R. E. A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).
- Schafer, A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum. Gene. 145, 69-73 (1994).
- Thorpe, H. M., Smith, M. C. In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).
- Jones, J. D., Gutterson, N. An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a. Gene. 61, 299-306 (1987).
- Beringer, J. E. R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).
- Lennox, E. S. Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1. Virology. 1, 190-206 (1955).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).
- Charles, T. C., Finan, T. M. Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b. J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).
- Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).
- Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening. Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Lesic, B., Rahme, L. G. Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa. BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).
- Choi, K. -. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).
- Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system. Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).
- Katzen, F. Gateway recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).
- Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations. Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).
