Site-specifieke bacteriële chromosoom Engineering: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)
Summary
Een snelle en efficiënte methode om vreemd DNA van belang te integreren in pre-en-klare acceptor stammen, aangeduid als landingsplaats stammen, beschreven. De methode maakt het mogelijk site-specifieke integratie van een DNA-cassette in de gemanipuleerde landingsplaats locus van een bepaalde stam, door middel van conjugatie en de expressie van de ΦC31 integrase.
Abstract
De bacteriële chromosoom kan worden gebruikt om vreemd DNA stabiel te houden in de mega-base bereik 1. De integratie in het chromosoom omzeilt onderwerpen als plasmide replicatie, plasmide stabiliteit, plasmide onverenigbaarheid, en plasmide aantal kopieën variantie. Deze methode maakt gebruik van de site-specific integrase van de Streptomyces faag (Φ) C31 2,3. De ΦC31 integrase katalyseert een directe recombinatie tussen twee specifieke DNA-sites: attB en attP (34 en 39 bp, respectievelijk) 4. Dit recombinatie stabiel is en niet terug 5. Een "landingsplaats" (LP) sequentie bestaande uit een spectinomycine-resistentiegen, aada (SPR) en E. coli ß-glucuronidase gen (uidA) geflankeerd door attP plaatsen is geïntegreerd in de chromosomen van Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi en Agrobacterium tumefaciens in een intergene regio, de ampc locus en de TETA locus respectievelijk. S. meliloti wordt in dit protocol. Mobiliseerbare vectoren die donor attB flankeren een stuffer rood fluorescent eiwit (RFP) gen en een antibioticumresistentiegen zijn aangelegd. In dit voorbeeld gentamicine resistente plasmide pJH110 gebruikt. De RFP gen 6 kan worden vervangen door een gewenste construct met Sphl en Pst I. Als alternatief kan een synthetische construct geflankeerd door attB sites kunnen sub-gekloneerd is in een mobiliseerbare vector, zoals pK19mob 7. De expressie van het ΦC31 integrase gen (gekloneerd pHS62 8) wordt aangedreven door de lac-promotor, een mobiliseerbare breed gastheerbereik plasmide pRK7813 9.
Een tetraparental koppelen protocol wordt gebruikt om de donor cassette over in de LP stam en vervangt de merkers met de LP sequentie met de donor cassette. Deze cellen zijn trans-integranten. Trans-integranten gevormd met een typische rendement van 0,5%. Trans-integranten zijn kenmerkend in de eerste 500-1000 kolonies gescreend met antibiotica gevoeligheid of blauw wit screenen met 5-bromo-4-chloor-3-indolyl-ß-D-glucuronzuur (X-Gluc). Dit protocol bevat de paren en de selectieprocedures voor het maken en isoleren van de trans-integranten.
Protocol
Discussion
De IMCE techniek maakt het mogelijk voor de efficiënte integratie van een enkele attB geflankeerd DNA-cassette in de LP-locus van een eerder ontworpen stam. Zodra de gewenste construct wordt gekloond in plaats van RFP aan de donor cassette te creëren, is de techniek niet nodig latere DNA-zuivering en transformatie, waardoor het zeer robuust. Het is cruciaal dat goede groei controles zijn opgenomen, om zeker te zijn van de resistentie tegen antibiotica is het gevolg van het ontstaan van trans-in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Om Margaret CM Smith voor vriendelijk het verstrekken van de integrase kloon
Financiering steun van:
Genome Canada / Genome Prairie
NSERC Discovery en strategische Projectsubsidies
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Streptomycin | Bioshop Canada Inc. | STP101 | |
| Spectinomycin | Bioshop Canada Inc. | SPE201 | |
| Gentamicin | Bioshop Canada Inc. | GTA202 | |
| Choramphenicol | Bioshop Canada Inc. | CLR201 | |
| Tetracycline | Bioshop Canada Inc. | TET701 | |
| Kanamycin | Bioshop Canada Inc. | KAN201 | |
| Bacteriological grade agar | Bioshop Canada Inc. | AGR001 | |
| Tryptone | Bioshop Canada Inc. | TRP402 | |
| Yeast Extract | Bioshop Canada Inc. | YEX401 | |
| Sodium Chloride | Bioshop Canada Inc. | SOD001 | |
| Calcium Chloride | Bioshop Canada Inc. | CCL444 | |
| X-gluc | Gold Biotechnology Inc. | G1281C1 | |
| E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
| E. coli pJC2 strain | In house, available by request | ||
| E. coli pJH110 strain | In house, available by request | ||
| SmUW227 strain | In house, available by request |
References
- Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).
- Kushtoss, S., Rao, R. N. Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31. J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).
- Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. Serine recombinases as tools for genome engineering. Methods. 53, 372-379 (2011).
- Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).
- Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination. Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).
- Campbell, R. E. A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).
- Schafer, A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum. Gene. 145, 69-73 (1994).
- Thorpe, H. M., Smith, M. C. In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).
- Jones, J. D., Gutterson, N. An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a. Gene. 61, 299-306 (1987).
- Beringer, J. E. R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).
- Lennox, E. S. Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1. Virology. 1, 190-206 (1955).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).
- Charles, T. C., Finan, T. M. Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b. J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).
- Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).
- Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening. Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Lesic, B., Rahme, L. G. Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa. BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).
- Choi, K. -. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).
- Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system. Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).
- Katzen, F. Gateway recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).
- Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations. Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).
