Сайт-специфическая бактериальная хромосома Инженерно: ΦC31 интегразы опосредованная кассеты бирже (IMCE)
Summary
Быстрый и эффективный способ для интеграции чужеродной ДНК интерес в готовых акцептором штаммов, называемых штаммов посадочной площадки, описан. Метод позволяет на конкретных участках интеграции ДНК кассету в инженерных локус площадку приземления данного штамма, через сопряжение и выражения ΦC31 интегразы.
Abstract
Бактериальной хромосомы могут быть использованы для поддержания стабильно чужеродной ДНК в мега-база от 1. Интеграция в хромосому обходит такие вопросы, как плазмиды репликации плазмиды стабильности, плазмиды несовместимости, и плазмиды дисперсии числа копий. Этот метод использует сайт-специфические интегразы из Streptomyces фага (Φ), C31 2,3. ΦC31 интегразы катализирует прямой рекомбинации между двумя определенными участками ДНК: attB и attP (34 и 39 б.п. соответственно), 4. Это рекомбинация является стабильной и не возвращается 5. "Посадочная площадка" (LP) последовательность, состоящая из спектиномицину ген устойчивости, Aada (СРП), и Е. палочки бета-глюкуронидазы ген (uidA) в окружении сайтов attP была интегрирована в хромосомах Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi и Agrobacterium tumefaciens в межгенных региона, утрапКл локус, и тета локус, соответственно. С. meliloti используется в данном протоколе. Mobilizable векторы донора содержащие attB сайтов фланговые писака красный флуоресцентный белок (RFP) гена и гена устойчивости к антибиотикам, также были построены. В этом примере гентамицина устойчивы плазмиды pJH110 используется. Ген RFP 6 может быть заменен на желаемую конструкцию использованием Sph я и Pst I. Кроме того синтетическая конструкция в окружении attB сайты могут быть суб-клонирован в вектор mobilizable таких как pK19mob 7. Выражение ΦC31 интегразы гена (клонированы из pHS62 8) приводится в движение промоутер лак на mobilizable широкий спектр хозяин плазмиды pRK7813 9.
Tetraparental протокола спаривания используется для передачи доноров кассету в LP штамм тем самым заменив маркеры в последовательности LP с донорами кассету. Эти клетки являются переходыS-интегрантов. Транс-интегрантов формируются с типичной эффективностью 0,5%. Транс-интегрантов которые обычно встречаются в первые 500-1000 колонии экранируется чувствительность к антибиотикам или сине-белые скрининга с использованием 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-глюкуроновой кислоты (X-Gluc). Этот протокол содержит спаривания и процедуру отбора для создания и выделения транс-интегрантов.
Protocol
Discussion
IMCE техника позволяет эффективно интегрировать одного attB окружении ДНК кассету в LP-локус ранее инженерии штамм. Как только желаемый конструкция клонированных вместо ППП для создания доноров кассеты, техника не требует последующей очистки ДНК и трансформации, что делает его о…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Для Маргарет Смит CM за любезно предоставленные интегразы клон
Финансирование поддержки:
Геном Канада / Геном Prairie
NSERC Discovery и стратегических проектов гранты
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Streptomycin | Bioshop Canada Inc. | STP101 | |
| Spectinomycin | Bioshop Canada Inc. | SPE201 | |
| Gentamicin | Bioshop Canada Inc. | GTA202 | |
| Choramphenicol | Bioshop Canada Inc. | CLR201 | |
| Tetracycline | Bioshop Canada Inc. | TET701 | |
| Kanamycin | Bioshop Canada Inc. | KAN201 | |
| Bacteriological grade agar | Bioshop Canada Inc. | AGR001 | |
| Tryptone | Bioshop Canada Inc. | TRP402 | |
| Yeast Extract | Bioshop Canada Inc. | YEX401 | |
| Sodium Chloride | Bioshop Canada Inc. | SOD001 | |
| Calcium Chloride | Bioshop Canada Inc. | CCL444 | |
| X-gluc | Gold Biotechnology Inc. | G1281C1 | |
| E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
| E. coli pJC2 strain | In house, available by request | ||
| E. coli pJH110 strain | In house, available by request | ||
| SmUW227 strain | In house, available by request |
References
- Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).
- Kushtoss, S., Rao, R. N. Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31. J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).
- Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. Serine recombinases as tools for genome engineering. Methods. 53, 372-379 (2011).
- Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).
- Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination. Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).
- Campbell, R. E. A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).
- Schafer, A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum. Gene. 145, 69-73 (1994).
- Thorpe, H. M., Smith, M. C. In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).
- Jones, J. D., Gutterson, N. An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a. Gene. 61, 299-306 (1987).
- Beringer, J. E. R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).
- Lennox, E. S. Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1. Virology. 1, 190-206 (1955).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).
- Charles, T. C., Finan, T. M. Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b. J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).
- Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).
- Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening. Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Lesic, B., Rahme, L. G. Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa. BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).
- Choi, K. -. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).
- Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system. Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).
- Katzen, F. Gateway recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).
- Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations. Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).
