Site-specific Ingegneria batterica Cromosoma: ΦC31 integrasi Mediated Cassette Exchange (IMCE)
Summary
Un metodo rapido ed efficace per integrare DNA estraneo di interesse in pre-fatti ceppi accettori, chiamati ceppi pista di atterraggio, è descritta. Il metodo permette integrazione sito-specifica di una cassetta DNA nel locus ingegnerizzato atterraggio di un dato ceppo, tramite coniugazione e l'espressione del ΦC31 integrasi.
Abstract
Il cromosoma batterico può essere utilizzato per mantenere stabilmente il DNA estraneo nel mega-base gamma 1. Integrazione nel cromosoma elude questioni quali la replicazione del plasmide, la stabilità plasmide, incompatibilità plasmide, e il plasmide varianza numero di copie. Questo metodo utilizza il site-specific integrasi dal fago Streptomyces (Φ) C31 2,3. Il ΦC31 integrasi catalizza una ricombinazione diretto tra due specifici siti del DNA: ATTB e attP (34 e 39 bp, rispettivamente) 4. Tale ricombinazione è stabile e non ripristinare 5. Una "pista" (LP) costituito da una sequenza spectinomicina gene di resistenza, aadA (SPR), e la E. coli ß-glucuronidasi gene (uidA) affiancato da siti attP è stato integrato nei cromosomi di Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi e tumefaciens in una regione intergenica, l'ampC locus, e il locus teta, rispettivamente. S. meliloti viene utilizzato in questo protocollo. Vettori contenenti siti donatori mobilizzabile attB fiancheggiano una stuffer rosso proteina fluorescente (RFP) gene e un gene di resistenza agli antibiotici sono stati costruiti. In questo esempio la gentamicina pJH110 resistente plasmide viene utilizzato. Il gene RFP 6 può essere sostituito con un costrutto desiderata con Sph I e Pst I. In alternativa, un costrutto sintetico fiancheggiata da siti attB possono essere subclonato in un vettore mobilizzabile come pK19mob 7. L'espressione del gene ΦC31 integrasi (clonato da pHS62 8) è guidata dal promotore lac, su una vasta gamma mobilizzabile ospite plasmide pRK7813 9.
Un protocollo accoppiamento tetraparental viene utilizzato per trasferire la cassetta nel ceppo donatore LP sostituendo i marcatori nella sequenza LP con la cassetta donatore. Queste cellule sono trans-integrants. Trans-integrants sono formate con una efficienza tipica di 0,5%. Trans-integrants trovano tipicamente entro i primi 500-1.000 colonie schermati dalla sensibilità agli antibiotici o blu-nero screening utilizzando 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-glucuronico (X-Gluc). Questo protocollo contiene le procedure di accoppiamento e di selezione per la creazione e isolare trans integranti.
Protocol
Discussion
La tecnica IMCE consente l'integrazione efficace di una singola cassetta DNA attB affiancato nella LP-locus di un ceppo precedentemente progettato. Una volta che il costrutto desiderato viene clonato al posto di RFP per creare la cassetta donatore, la tecnica non richiede successiva purificazione del DNA e trasformazione, che rende molto robusto. È fondamentale che controlli crescita appropriati sono inclusi, per essere certi della resistenza agli antibiotici è dovuta alla creazione di trans-inte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Per CM Margaret Smith per aver gentilmente fornire il clone integrasi
Un sostegno finanziario a partire da:
Genome Canada / Genome Prairie
NSERC Discovery e borse di studio progetti strategici
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Streptomycin | Bioshop Canada Inc. | STP101 | |
| Spectinomycin | Bioshop Canada Inc. | SPE201 | |
| Gentamicin | Bioshop Canada Inc. | GTA202 | |
| Choramphenicol | Bioshop Canada Inc. | CLR201 | |
| Tetracycline | Bioshop Canada Inc. | TET701 | |
| Kanamycin | Bioshop Canada Inc. | KAN201 | |
| Bacteriological grade agar | Bioshop Canada Inc. | AGR001 | |
| Tryptone | Bioshop Canada Inc. | TRP402 | |
| Yeast Extract | Bioshop Canada Inc. | YEX401 | |
| Sodium Chloride | Bioshop Canada Inc. | SOD001 | |
| Calcium Chloride | Bioshop Canada Inc. | CCL444 | |
| X-gluc | Gold Biotechnology Inc. | G1281C1 | |
| E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
| E. coli pJC2 strain | In house, available by request | ||
| E. coli pJH110 strain | In house, available by request | ||
| SmUW227 strain | In house, available by request |
References
- Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).
- Kushtoss, S., Rao, R. N. Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31. J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).
- Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. Serine recombinases as tools for genome engineering. Methods. 53, 372-379 (2011).
- Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).
- Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination. Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).
- Campbell, R. E. A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).
- Schafer, A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum. Gene. 145, 69-73 (1994).
- Thorpe, H. M., Smith, M. C. In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).
- Jones, J. D., Gutterson, N. An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a. Gene. 61, 299-306 (1987).
- Beringer, J. E. R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).
- Lennox, E. S. Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1. Virology. 1, 190-206 (1955).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).
- Charles, T. C., Finan, T. M. Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b. J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).
- Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).
- Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening. Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Lesic, B., Rahme, L. G. Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa. BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).
- Choi, K. -. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).
- Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system. Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).
- Katzen, F. Gateway recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).
- Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations. Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).
