Site-spezifische bakterielle Chromosom Engineering: ΦC31 Integrase vermittelte Cassette Exchange (IMCE)
Summary
Eine schnelle und effiziente Methode, um Fremd-DNA von Interesse in vorgefertigte Akzeptor Stämme, sogenannte Landing-Pad-Stämme, die Integration beschrieben wird. Das Verfahren erlaubt eine ortsspezifische Integration eines DNA-Kassette in die gentechnisch Landeplatz Ort einer gegebenen Dehnung, durch Konjugation und Expression des ΦC31 Integrase.
Abstract
Die Bakterien-Chromosom kann verwendet werden, um stabil zu halten Fremd-DNA in der Mega-Basen-Bereich 1 werden. Integration in das Chromosom umgeht Themen wie Plasmidreplikation, der Stabilität von Plasmiden, Plasmid Inkompatibilität und Plasmid-Kopienzahl Varianz. Diese Methode verwendet die ortsspezifische Integrase aus dem Streptomyces Phagen (Φ) C31 2,3. Die Integrase katalysiert ΦC31 eine direkte Rekombination zwischen zwei spezifischen DNA-sites: attB und attP (34 und 39 bp) 4. Diese Rekombination ist stabil und nicht zurückkehren 5. Ein "Landeplatz" (LP)-Sequenz bestehend aus einer Spectinomycin-Resistenz-Gen, aadA (SPR) und der E. coli ß-Glucuronidase-Gen (uidA) von attP flankiert in die Chromosomen der Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi und Agrobacterium tumefaciens in einem Zwischengenregion integriert wurde, bin daspC Locus und die tetA Locus, jeweils. S. meliloti ist in diesem Protokoll verwendet. Mobilisierbaren Vektoren, die Donor attB flankieren eine Stuffer rot fluoreszierendes Protein (RFP)-Gen und ein Antibiotika-Resistenz-Gen wurde ebenfalls konstruiert. In diesem Beispiel wird Gentamicin resistente Plasmid pJH110 verwendet wird. Der RFP-Gen 6 kann mit einem gewünschten Konstrukt mit Sph I und Pst I ersetzt werden Alternativ kann ein synthetisches Konstrukt von attB-Stellen flankiert sein können subkloniert in einen mobilisierbaren Vektor wie pK19mob 7. Die Expression des Integrase-Gens ΦC31 (kloniert von pHS62 8) durch den lac-Promotor angetrieben wird, auf einem mobilisierbaren Plasmids mit breitem Wirtsbereich pRK7813 9.
Ein tetraparental passenden Protokoll wird verwendet, um den Spender Kassette in der LP-Stamm und ersetzt die Marker in der LP-Sequenz mit der Donor-Kassette zu übertragen. Diese Zellen sind trans-Integranten. Trans-Integranten werden mit einem typischen Wirkungsgrad von 0,5% gebildet. Trans-Integranten werden typischerweise innerhalb der ersten 500-1,000 Kolonien durch Antibiotika-Empfindlichkeit oder blau-Weiß-Screening unter Verwendung von 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-Glucuronsäure (X-gluc) gescreent vorhanden. Dieses Protokoll enthält die Paarungs-und Auswahlverfahren für das Erstellen und Isolieren von trans-Integranten.
Protocol
Discussion
Die IMCE Technik ermöglicht die effiziente Integration von einem einzigen attB flankiert DNA-Kassette in die LP-Locus eines zuvor entwickelten Stamm. Sobald das gewünschte Konstrukt anstelle der RFP, den Spender Kassette erstellen geklont wird, kommt die Technik nicht erforderlich, anschließende DNA-Reinigung und Transformation, so dass es sehr robust. Es ist wichtig, dass geeignete Wachstumsbedingungen Steuerelemente enthalten sind, sicher zu sein, die Resistenz gegen Antibiotika aufgrund der Erzeu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Um Margaret CM Smith für die freundliche Bereitstellung des Integrase-Klon
Drittmittelförderung von:
Genome Kanada / Genome Prairie
NSERC Discovery and Strategic Project Zuschüsse
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Streptomycin | Bioshop Canada Inc. | STP101 | |
| Spectinomycin | Bioshop Canada Inc. | SPE201 | |
| Gentamicin | Bioshop Canada Inc. | GTA202 | |
| Choramphenicol | Bioshop Canada Inc. | CLR201 | |
| Tetracycline | Bioshop Canada Inc. | TET701 | |
| Kanamycin | Bioshop Canada Inc. | KAN201 | |
| Bacteriological grade agar | Bioshop Canada Inc. | AGR001 | |
| Tryptone | Bioshop Canada Inc. | TRP402 | |
| Yeast Extract | Bioshop Canada Inc. | YEX401 | |
| Sodium Chloride | Bioshop Canada Inc. | SOD001 | |
| Calcium Chloride | Bioshop Canada Inc. | CCL444 | |
| X-gluc | Gold Biotechnology Inc. | G1281C1 | |
| E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
| E. coli pJC2 strain | In house, available by request | ||
| E. coli pJH110 strain | In house, available by request | ||
| SmUW227 strain | In house, available by request |
References
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