サイト固有の細菌染色体工学：ΦC31インテグラーゼを介したカセット取引所（IMCE）
Summary
既製のアクセプター株、と呼ばれる着陸パッド株に興味のある外来DNAを統合するための迅速かつ効率的な方法が記載されている。メソッドは、ΦC31インテグラーゼの結合と表現を通して、与えられた菌株の人工着陸パッドの座にDNAカセットの部位特異的に統合することができます。
Abstract
細菌の染色体を安定的にメガ塩基の範囲1に外来DNAを維持するために使用されることがあります。染色体への統合は、このようなプラスミド複製、プラスミドの安定性、プラスミド不和合性、プラスミドコピー数の変動などの問題を回避します。このメソッドは、 放線菌ファージ（Φ）C31 2,3から、サイト固有のインテグラーゼを使用しています。 attBとattP（それぞれ34と39 bpの、）4：ΦC31インテグラーゼは、2つの特定のDNA部位の間の直接的な組換えを触媒する。この組換えは、安定していると5を戻すことはできません。スペクチノマイシン耐性遺伝子、aadA（SPR）、およびE.から成る"ランディングパッド"（LP）シーケンスattP部位によって挟まれた大腸菌 β-グルクロニダーゼ遺伝子（uidA）Sinorhizobium根粒、Ochrobactrum anthropiと、遺伝子間領域におけるAgrobacterium tumefaciensの染色体に組み込まれており、 午前それぞれpCの軌跡、そしてTETA軌跡、S.根粒は、このプロトコルで使用されています。スタッファー赤色蛍光タンパク質（RFP）遺伝子と抗生物質耐性遺伝子に隣接するattB部位を含む可動性ドナーベクターも構築されている。この例では、ゲンタマイシン耐性プラスミドpJH110が使用されます。 RFP遺伝子の 6は SPH I と Pst Iを用いて所望の構築物で置き換えることができますまたattB部位に隣接した合成構造などpK19mob 7のような可動性ベクターにサブクローン化されたかもしれません。 ΦC31インテグラーゼ遺伝子の発現（pHS62 8からクローニングされた）pRK7813 9可動性プラスミド広宿主範囲に、lacプロモーターによって駆動されます。
tetraparental交配プロトコルは、それによってドナーカセットでLPシーケンスにマーカーを置き換えるLP株にドナーカセットを転送するために使用されます。これらの細胞はトランジスタです。S-組込み体。トランス組込み体は、0.5％の典型的な効率で形成される。トランス組込み体は、通常、抗生物質感受性または5 – ブロモ-4 – クロロ-3 – インドリル-β-D-グルクロン酸（X-gluc）を使用して青白色スクリーニングでスクリーニング第一500〜1,000コロニー内にあります。このプロトコルは、トランス組込み体を作成し、単離するための交配と選択プロシージャが含まれています。
Protocol
Discussion
IMCE技術は、以前に設計された株のLP-遺伝子座への単一attB挟まれたDNAカセットの効率的な統合が可能になります。希望するコンストラクトがドナーカセットを作成するRFPの代わりにクローン化されると、技術は非常に堅牢な作り、その後のDNA精製と変換を必要としません。それは抗生物質耐性は、トランス組込み体の作成とない他の要因によるものであることを確実にするため?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
親切なインテグラーゼクローンを提供するためのマーガレットCMスミスへ
からの資金調達のサポート：
ゲノムカナダ/ゲノムプレーリー
NSERC発見と戦略プロジェクトの助成金
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Streptomycin | Bioshop Canada Inc. | STP101 | |
| Spectinomycin | Bioshop Canada Inc. | SPE201 | |
| Gentamicin | Bioshop Canada Inc. | GTA202 | |
| Choramphenicol | Bioshop Canada Inc. | CLR201 | |
| Tetracycline | Bioshop Canada Inc. | TET701 | |
| Kanamycin | Bioshop Canada Inc. | KAN201 | |
| Bacteriological grade agar | Bioshop Canada Inc. | AGR001 | |
| Tryptone | Bioshop Canada Inc. | TRP402 | |
| Yeast Extract | Bioshop Canada Inc. | YEX401 | |
| Sodium Chloride | Bioshop Canada Inc. | SOD001 | |
| Calcium Chloride | Bioshop Canada Inc. | CCL444 | |
| X-gluc | Gold Biotechnology Inc. | G1281C1 | |
| E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
| E. coli pJC2 strain | In house, available by request | ||
| E. coli pJH110 strain | In house, available by request | ||
| SmUW227 strain | In house, available by request |
References
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