साइट - विशिष्ट बैक्टीरियल क्रोमोजोम अभियांत्रिकी: ΦC31 इंटिग्रेस मध्यस्थता कैसेट्स विनिमय (IMCE)
Summary
एक त्वरित और कुशल पूर्व स्वीकर्ता उपभेदों, करार दिया लैंडिंग पैड उपभेदों में ब्याज की विदेशी डीएनए एकीकृत विधि वर्णित है. विधि एक भी तनाव के इंजीनियर लैंडिंग पैड ठिकाना में विकार और ΦC31 इंटिग्रेस की अभिव्यक्ति के माध्यम से एक डीएनए कैसेट की साइट विशेष एकीकरण की अनुमति देता है.
Abstract
बैक्टीरियल गुणसूत्र stably मेगा आधार सीमा 1 में विदेशी डीएनए बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. गुणसूत्र में एकता प्लाज्मिड प्रतिकृति, प्लाज्मिड स्थिरता, प्लाज्मिड असंगति, और प्लाज्मिड प्रतिलिपि संख्या विचरण जैसे मुद्दों circumvents. इस विधि Streptomyces फेज (Φ) C31 2,3 से इंटिग्रेस साइट विशेष का उपयोग करता है. AttB और attP (34 और 39 बीपी, क्रमशः) 4: ΦC31 इंटिग्रेस दो विशिष्ट डीएनए साइटों के बीच एक सीधा पुनर्संयोजन catalyzes. यह पुनर्संयोजन स्थिर है और करता है 5 वापस लौटने नहीं है. (LP) एक "लैंडिंग पैड" जीन spectinomycin प्रतिरोध, aadA (SPR), और ई से मिलकर अनुक्रम कोलाई एसएस glucuronidase (uidA) जीन attP साइटों द्वारा flanked Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, और एक intergenic क्षेत्र में Agrobacterium tumefaciens के गुणसूत्रों में एकीकृत किया गया है हूँ,पीसी ठिकाना, और teta ठिकाना, क्रमशः एस. meliloti इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है. दाता गतिक्षम्य attB साइटों flanking एक stuffer लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) जीन और एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन युक्त वैक्टर भी निर्माण किया गया है. Gentamicin प्रतिरोधी प्लाज्मिड pJH110 इस उदाहरण में प्रयोग किया जाता है. RFP 6 जीन एक वांछित Sph मैं और pst मैं का उपयोग करते हुए निर्माण के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है वैकल्पिक रूप से एक कृत्रिम निर्माण attB साइटों द्वारा flanked उप क्लोन ऐसे 7 pK19mob के रूप में एक गतिक्षम्य वेक्टर में हो सकता है. ΦC31 इंटिग्रेस जीन (8 pHS62 क्लोन है) के अभिव्यक्ति लाख प्रमोटर द्वारा संचालित है, एक गतिक्षम्य व्यापक मेजबान 9 pRK7813 प्लाज्मिड सीमा पर,.
एक tetraparental संभोग प्रोटोकॉल के एल.पी. तनाव जिससे दाता कैसेट के साथ एल.पी. अनुक्रम में मार्कर की जगह में दाता कैसेट हस्तांतरण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इन कोशिकाओं को ट्रॅनएस integrants. ट्रांस integrants 0.5% की एक विशिष्ट दक्षता के साथ गठन कर रहे हैं. ट्रांस integrants आम तौर पर पहले 500-1,000 एंटीबायोटिक संवेदनशीलता या नीला सफेद स्क्रीनिंग 5 – ब्रोमो – 4 – क्लोरो – 3 indolyl बीटा – डी – ग्लुकुरोनिक एसिड (एक्स gluc) का उपयोग करके जांच की कालोनियों के भीतर पाए जाते हैं. इस प्रोटोकॉल बनाने और अलग पार integrants के लिए संभोग और चयन प्रक्रिया में शामिल है.
Protocol
Discussion
IMCE तकनीक एकल attB चारों पहले इंजीनियर तनाव की एल.पी. बिन्दुपथ में डीएनए कैसेट के कुशल एकीकरण के लिए अनुमति देता है. एक बार वांछित निर्माण rfp की जगह दाता कैसेट बनाने में क्लोन है, तकनीक के बाद डीएनए शुद्…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कृपया इंटिग्रेस क्लोन प्रदान करने के लिए मार्गरेट मुख्यमंत्री स्मिथ
से समर्थन अनुदान:
जीनोम / कनाडा जीनोम Prairie
से NSERC डिस्कवरी और सामरिक परियोजना अनुदान
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Streptomycin | Bioshop Canada Inc. | STP101 | |
| Spectinomycin | Bioshop Canada Inc. | SPE201 | |
| Gentamicin | Bioshop Canada Inc. | GTA202 | |
| Choramphenicol | Bioshop Canada Inc. | CLR201 | |
| Tetracycline | Bioshop Canada Inc. | TET701 | |
| Kanamycin | Bioshop Canada Inc. | KAN201 | |
| Bacteriological grade agar | Bioshop Canada Inc. | AGR001 | |
| Tryptone | Bioshop Canada Inc. | TRP402 | |
| Yeast Extract | Bioshop Canada Inc. | YEX401 | |
| Sodium Chloride | Bioshop Canada Inc. | SOD001 | |
| Calcium Chloride | Bioshop Canada Inc. | CCL444 | |
| X-gluc | Gold Biotechnology Inc. | G1281C1 | |
| E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
| E. coli pJC2 strain | In house, available by request | ||
| E. coli pJH110 strain | In house, available by request | ||
| SmUW227 strain | In house, available by request |
References
- Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).
- Kushtoss, S., Rao, R. N. Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31. J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).
- Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. Serine recombinases as tools for genome engineering. Methods. 53, 372-379 (2011).
- Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).
- Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination. Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).
- Campbell, R. E. A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).
- Schafer, A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum. Gene. 145, 69-73 (1994).
- Thorpe, H. M., Smith, M. C. In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).
- Jones, J. D., Gutterson, N. An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a. Gene. 61, 299-306 (1987).
- Beringer, J. E. R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).
- Lennox, E. S. Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1. Virology. 1, 190-206 (1955).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).
- Charles, T. C., Finan, T. M. Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b. J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).
- Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).
- Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening. Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Lesic, B., Rahme, L. G. Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa. BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).
- Choi, K. -. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).
- Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system. Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).
- Katzen, F. Gateway recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).
- Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations. Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).
