Platsspecifik bakteriekromosomen Engineering: ΦC31 Integras Mediated kassett Exchange (IMCE)
Summary
En snabb och effektiv metod för att integrera främmande DNA av intresse i färdiga acceptor stammar, sk landning pad stammar, beskrivs. Metoden tillåter platsspecifik integration av ett DNA-kassett in i den konstruerade landningsplats lokus för en given stam, genom konjugering och uttryck av ΦC31 integras.
Abstract
Den bakteriella kromosomen kan användas för att stabilt hålla främmande DNA i mega-basen intervallet 1. Integrering i kromosomen kringgår frågor som plasmidreplikation, plasmidstabilitet, plasmid inkompatibilitet och plasmidkopieantalet varians. Denna metod används platsspecifika integras från Streptomyces fag (Φ) C31 2,3. Den ΦC31 integras katalyserar en direkt rekombination mellan två specifika DNA webbplatser: attB och attP (34 och 39 bp respektive) 4. Denna rekombination är stabil och inte återgå 5. En "landning dyna" (LP)-sekvens bestående av en spektinomycin-resistensgen, aadA (SPR), och E. coli ß-glukuronidasgenen (uidA) flankerad av ATTP ställen har integrerats i kromosomerna i Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi och Agrobacterium tumefaciens i en intergenregion, AMpC-lokuset och den tetA-lokuset, respektive. S. meliloti används i detta protokoll. Mobiliserbara donator vektorer innehållande attB-ställen som flankerar en stuffer röd fluorescerande protein (RFP)-genen och en gen för antibiotikaresistens har också konstruerats. I detta exempel är gentamicin resistenta plasmiden pJH110 används. RFP-genen 6 kan ersättas med en önskad konstruktion med användning av Sphl-och Pstl Alternativt en syntetisk konstruktion flankerad av attB ställen kan vara sub-klonades in i en mobiliserbar vektor såsom pK19mob 7. Uttrycket av ΦC31 integras-genen (klonad från pHS62 8) drives av lac-promotorn, på en mobiliserbar brett värdområde plasmiden pRK7813 9.
En tetraparental parning protokoll används för att överföra givaren kassetten in i LP-stam därigenom ersätta markörer i LP-sekvensen med givaren kassetten. Dessa celler är trans-integranter. Trans-integranter är utformade med en typisk effektivitet av 0,5%. Trans-integranter normalt återfinns inom de första 500-1,000 kolonier screenades genom antibiotikakänslighet eller blå-vit screening med användning av 5-brom-4-klor-3-indolyl-beta-D-glukuronsyra (X-gluc). Detta protokoll innehåller parning och urvalsförfaranden för att skapa och isolera trans-integranter.
Protocol
Discussion
Den IMCE Tekniken möjliggör effektiv integrering av ett enda flankerad attB DNA-kassett till LP-platsen för en tidigare konstruerad stam. När den önskade konstruktionen klonas i stället för RFP för att skapa givaren kassetten kräver tekniken inte efterföljande DNA rening och transformation, vilket gör det mycket robust. Det är viktigt att lämpliga tillväxt kontroller ingår, för att vara säker på att antibiotikaresistens beror på skapandet av trans-integranter och inte andra faktorer….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Margaret CM Smith vänligt ge integras klonen
Finansiering stöd från:
Genome Canada / Genome Prairie
NSERC Discovery och strategiska projektbidrag
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Streptomycin | Bioshop Canada Inc. | STP101 | |
| Spectinomycin | Bioshop Canada Inc. | SPE201 | |
| Gentamicin | Bioshop Canada Inc. | GTA202 | |
| Choramphenicol | Bioshop Canada Inc. | CLR201 | |
| Tetracycline | Bioshop Canada Inc. | TET701 | |
| Kanamycin | Bioshop Canada Inc. | KAN201 | |
| Bacteriological grade agar | Bioshop Canada Inc. | AGR001 | |
| Tryptone | Bioshop Canada Inc. | TRP402 | |
| Yeast Extract | Bioshop Canada Inc. | YEX401 | |
| Sodium Chloride | Bioshop Canada Inc. | SOD001 | |
| Calcium Chloride | Bioshop Canada Inc. | CCL444 | |
| X-gluc | Gold Biotechnology Inc. | G1281C1 | |
| E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
| E. coli pJC2 strain | In house, available by request | ||
| E. coli pJH110 strain | In house, available by request | ||
| SmUW227 strain | In house, available by request |
References
- Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).
- Kushtoss, S., Rao, R. N. Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31. J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).
- Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. Serine recombinases as tools for genome engineering. Methods. 53, 372-379 (2011).
- Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).
- Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination. Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).
- Campbell, R. E. A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).
- Schafer, A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum. Gene. 145, 69-73 (1994).
- Thorpe, H. M., Smith, M. C. In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).
- Jones, J. D., Gutterson, N. An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a. Gene. 61, 299-306 (1987).
- Beringer, J. E. R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).
- Lennox, E. S. Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1. Virology. 1, 190-206 (1955).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).
- Charles, T. C., Finan, T. M. Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b. J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).
- Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).
- Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening. Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Lesic, B., Rahme, L. G. Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa. BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).
- Choi, K. -. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).
- Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system. Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).
- Katzen, F. Gateway recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).
- Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations. Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).
