وحيدة الخلية التنميط من الخلايا العصبية الشبكية المتطورة والناضجة

Summary

تم وصف طريقة لعزل خلايا الشبكية واحد، والتضخيم لاحق من cDNAs بهم. وحيدة الخلية transcriptomics يكشف عن درجة من عدم التجانس الحالي الخلوي في الأنسجة والجينات تكشف علامة جديدة للسكان الخلية نادر. ويمكن تعديل البروتوكول المرافق لتتناسب مع العديد من أنواع مختلفة من الخلايا.

Abstract

السكان درجة عالية من التخصص، ولكنها صغيرة جدا من الخلايا تلعب دورا هاما في العديد من الأنسجة. وكان تحديد خلية من نوع علامات وبرامج محددة التعبير الجيني للخلية فرعية نادرة للغاية تحديا باستخدام معيار كامل الأنسجة النهج. التنميط الجيني التعبير من الخلايا الفردية تسمح للوصول لم يسبق لها مثيل إلى أنواع الخلايا التي تشكل إلا نسبة ضئيلة من مجموع النسيج ^1-7. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة البرامج التعبير الجيني الذي يتم التعبير عن عابر في أعداد صغيرة من الخلايا خلال التحولات التنموية الحيوية ^8.

هذه مسألة التنوع الخلوية تنشأ مرارا وتكرارا في الجهاز العصبي المركزي (CNS) حيث الوصلات العصبية يمكن أن يحدث بين خلايا مختلفة تماما ^9. العدد الدقيق للأنواع الخلايا متميزة ليس معروفا على وجه التحديد، ولكن لم يقدر أنه قد يكون هناك ما يصل الى 1000 من أنواع مختلفة في القشرة أناtself ^10. قد تكون وظيفة (ق) من الدوائر العصبية المعقدة الاعتماد على بعض أنواع الخلايا العصبية النادرة والجينات التي تعبر عنها. من خلال تحديد علامات جديدة وتساعد على تصنيف جزيئيا الخلايا العصبية المختلفة، ونهج وحيد الخلية هو مفيدة بشكل خاص في تحليل أنواع الخلايا في الجهاز العصبي. كما قد يساعد على توضيح آليات تطوره العصبي عن طريق تحديد الجينات وأعرب تفاضلي ومسارات الجينات خلال المراحل الأولى من التنمية سلف الخلايا العصبية.

كما منديل، بسيط الوصول إليها بسهولة مع تنوع كبير الخلايا العصبية، في شبكية العين عند الفقاريات هو نظام نموذجا ممتازا لدراسة عمليات التنمية الخلوية، وتمايز الخلايا العصبية وتنويع الخلايا العصبية. ومع ذلك، كما هو الحال في أجزاء أخرى من الجهاز العصبي المركزي، ويمكن لهذا التنوع الخلوية يمثل مشكلة لتحديد مسارات الوراثية التي تدفع الأسلاف شبكية العين إلى اعتماد مصير خلية معينة، وخصوصا ان مبصرات قضيب يشكلون أماهjority من السكان خلايا شبكية المجموع ^11. هنا نقدم تقريرا عن طريقة لتحديد هوية النصوص التي أعرب عنها في خلايا الشبكية واحد (الشكل 1). أسلوب التنميط وحيدة الخلية يسمح لتقييم حجم السكان الحالي عدم التجانس داخل الخلوية المختلفة من شبكية العين ^2،4،5،12. وبالإضافة إلى ذلك، فقد كشفت هذه الطريقة مجموعة من الجينات المرشحة الجديدة التي قد تلعب دور (ق) في مصير الخلية عمليات صنع القرار التي تحدث في مجموعات فرعية من الخلايا الاصلية في شبكية العين ^8. مع بعض التعديلات البسيطة في البروتوكول، يمكن أن تستخدم هذه التقنية لأنسجة عديدة ومختلفة وأنواع الخلايا.

Protocol

1. خلية التفكك مخطط انسيابي يحدد بروتوكول يظهر هو الشكل 1. لأرقام التسويقي للكواشف خاصة لاستخدامه خلال هذا البروتوكول، يرجى الرجوع إلى الجدول رقم 1. تشريح شبكية العين في حمام برنامج تلفزيوني. خلال تشر…

Discussion

عدد الآخذة في التوسع من الدراسات التي تكشف عن قوة الخلية الى خلية التغير في السكان الذين يعتقد انهم كانوا أكثر تجانسا فيما يتعلق التعبير الجيني على ^6،8. في واحدة على الأقل، وقد تبين أن هذا الجين التعبير عن "الضجيج" للعب وظيفة هامة البيولوجية ^13. وتحجب ا?…

Materials

Reaction mixtures:

Cell Lysis buffer

0.45 μ	10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)
0.23 μl	10% NP-40
0.23 μl	0.1M DTT
0.05 μl	RNase Inhibitor (40 U/μl)
0.05 μl	SUPERase-In (20U/μl)
0.13 μl	Modified Oligo d(T) primer (TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)
0.09 μl	dNTPs (2.5 mM each)
3.27 μl	dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures)

Tailing Reaction Mixture

0.18 μl	100 mM dATP
0.6 μl	10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)
4.62 μl	dH2O
0.3 μl	TdT (400 U/μl)
0.3 μl	RNase H (2 U/μl)

PCR Reaction Mixture

10 μl	10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+
10 μl	2.5 mM dNTPs
0.2 μl	Modified Oligo d(T) primer (10 μg/μl)
1 μl	Ex-Taq HS Polymerase (5U/μl)
68.8 μl	dH2O

10X One-Phor All Buffer

0.5M	Potassium acetate
0.1M	Tris acetate (pH 7.6)
0.1M	Magnesium acetate

Solutions:

10X Phosphate buffered saline (1 liter)

80g NaCl
2g KCl
14.4 g Na₂PO₄
2.4 g KH₂PO₄
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
Vertical needle puller	David Kopf Instruments	Model 750
Microcapillary tubes	Sigma	P0674
Aspirator tube assembly	Sigma	A5177
Corning filter tips (100-1000 μl	Fisher Scientific	07-200-265
Hank’s balanced salt solution (1X)	Lonza BioWhittaker	10-508F
HEPES buffer (1M)	MP Biomedicals	091688449
Bovine serum albumin	Sigma	A9418
DNase I	Roche	04716728001
papain	Worthington	LS03126
Superscript III	Invitrogen	18080-044
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	AM2682	These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.
SUPERase-In	Applied Biosystems	AM2694	These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.
Modified Oligo d(T) primer (gel purified)	Oligos ETC		We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC.
T4 gene 32 protein	New England Biolabs	M0300L
Exonuclease I	New England Biolabs	M0293S
TdT	Roche	3 333 574	As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results.
RNase H	Invitrogen	18021-014
Ex-Taq HS Polymerase	Takara	RR006A
Biotin N6-ddATP	Enzo Biosciences	42809

Table 1. Specific reagents and equipment.