Gelişen ve Olgun Retina Nöronlar Tek hücreli Profilleme
Summary
Tek retina hücreleri ve bunların cDNAlann sonraki amplifikasyon izolasyonu için bir yöntem tarif edilmiştir. Tek hücreli transkriptomik bir dokusunda hücresel heterojenite mevcut derecesini ortaya koymaktadır ve nadir hücre popülasyonu için yeni belirteç genlerin ortaya çıkarır. Beraberindeki protokol birçok farklı hücre tiplerine uyacak şekilde ayarlanabilir.
Abstract
Hücrelerin çok özel, ama son derece küçük popülasyonlarda çok dokuda önemli rol oynamaktadır. Son derece nadir hücre alt grupları için hücre türüne özgü marker ve gen ekspresyonu programlarının belirlenmesi standart bütün doku yaklaşımları kullanarak bir meydan okuma olmuştur. Bireysel hücre gen ifadesi profil toplam doku 1-7 sadece küçük bir yüzdesi ihtiva hücre tipleri için eşsiz erişim sağlar. Buna ek olarak, bu teknik geçici olarak dinamik bir gelişim geçişleri sırasında 8 hücreleri az sayıda cinsinden ifade edilmiştir gen ifadesi programları incelemek için kullanılabilir.
Hücresel çeşitlilik Bu sorun nöronal bağlantıları 9 oldukça farklı hücreler arasında oluşabilir merkezi sinir sistemi (SSS) tekrar tekrar ortaya çıkar. Farklı hücre tipleri kesin sayısı tam olarak bilinmemektedir, ancak korteks i kadar 1000 farklı tipte olabileceği tahmin edilmektedirtself 10. Karmaşık sinirsel devrelerin fonksiyonu (ler) nadir görülen nöronal türleri ve bunların ifade genlerin bazı bağımlı olabilir. Yeni bir belirteç tanımlanması ve moleküler olarak farklı nöronların sınıflandırmak için yardımcı olarak, tek bir hücre yaklaşımı sinir sisteminde hücre tiplerinin analizi özellikle faydalıdır. Ayrıca nöronal progenitör gelişiminin erken aşamalarında Farklı olarak ifade genler ve gen yolları tespit ederek nöral gelişim mekanizmaları aydınlatmak için yardımcı olabilir.
Önemli nöronal çeşitliliği ile basit, kolay erişilebilir dokusu gibi, gözdeki hücresel gelişim, nöronal farklılaşma ve nöronal çeşitlendirme süreçleri incelemek için mükemmel bir model sistemidir. Ancak, merkezi sinir sistemi diğer bölgelerinde olduğu gibi, bu hücresel çeşitlilik çubuk fotoreseptör ma makyaj özellikle göz önüne alındığında, belirli bir hücre kaderinin benimsemeye retina ataları sürücü genetik yollarının belirlenmesi için bir sorun olabilirtotal retina hücre popülasyonu 11 bununla birlikte, çoğunluk. Burada tek retina hücreleri (Şekil 1) ile ifade transkriptlerin belirlenmesi için bir yöntem sunulmaktadır. Tek-hücre profil tekniği retinanın 2,4,5,12 farklı hücresel popülasyonları içinde heterojenite Mevcut miktarının değerlendirilmesi için olanak sağlar. Buna ek olarak, bu yöntem hücre kaderinin retina progenitör hücrelerin alt 8 meydana karar alma süreçlerinde rol (ler) oynayabilir yeni aday genler bir dizi ortaya çıkarmıştır. Protokolü için bazı basit ayarlamalar ile, bu teknik birçok farklı doku ve hücre tipleri için kullanılabilir.
Protocol
Discussion
Çalışmaların sürekli genişleyen sayısı, gen ekspresyon 6,8 açısından daha homojen olduğu inanılan toplumlarda sağlam hücreden hücreye değişkenliği ortaya koymaktadır. En az bir örneği olarak, bu gen ifadesi "gürültü" önemli bir biyolojik fonksiyonları 13 oynamak için gösterilmiştir. Tek tek hücreler arasında gen ekspresyonu farklılıklar geleneksel bütün doku yöntemleri kullanarak gizlenmiş edilir. Bu deneyler temsilcisi 14 olmayabilir "…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
Reaction mixtures:
Cell Lysis buffer
| 0.45 μ | 10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2) |
| 0.23 μl | 10% NP-40 |
| 0.23 μl | 0.1M DTT |
| 0.05 μl | RNase Inhibitor (40 U/μl) |
| 0.05 μl | SUPERase-In (20U/μl) |
| 0.13 μl | Modified Oligo d(T) primer (TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT) |
| 0.09 μl | dNTPs (2.5 mM each) |
| 3.27 μl | dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures) |
Tailing Reaction Mixture
| 0.18 μl | 100 mM dATP |
| 0.6 μl | 10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2) |
| 4.62 μl | dH2O |
| 0.3 μl | TdT (400 U/μl) |
| 0.3 μl | RNase H (2 U/μl) |
PCR Reaction Mixture
| 10 μl | 10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+ |
| 10 μl | 2.5 mM dNTPs |
| 0.2 μl | Modified Oligo d(T) primer (10 μg/μl) |
| 1 μl | Ex-Taq HS Polymerase (5U/μl) |
| 68.8 μl | dH2O |
10X One-Phor All Buffer
| 0.5M | Potassium acetate |
| 0.1M | Tris acetate (pH 7.6) |
| 0.1M | Magnesium acetate |
Solutions:
10X Phosphate buffered saline (1 liter)
80g NaCl
2g KCl
14.4 g Na2PO4
2.4 g KH2PO4
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Vertical needle puller | David Kopf Instruments | Model 750 | |
| Microcapillary tubes | Sigma | P0674 | |
| Aspirator tube assembly | Sigma | A5177 | |
| Corning filter tips (100-1000 μl | Fisher Scientific | 07-200-265 | |
| Hank’s balanced salt solution (1X) | Lonza BioWhittaker | 10-508F | |
| HEPES buffer (1M) | MP Biomedicals | 091688449 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| DNase I | Roche | 04716728001 | |
| papain | Worthington | LS03126 | |
| Superscript III | Invitrogen | 18080-044 | |
| RNase Inhibitor | Applied Biosystems | AM2682 | These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear. |
| SUPERase-In | Applied Biosystems | AM2694 | These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear. |
| Modified Oligo d(T) primer (gel purified) | Oligos ETC | We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC. | |
| T4 gene 32 protein | New England Biolabs | M0300L | |
| Exonuclease I | New England Biolabs | M0293S | |
| TdT | Roche | 3 333 574 | As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results. |
| RNase H | Invitrogen | 18021-014 | |
| Ex-Taq HS Polymerase | Takara | RR006A | |
| Biotin N6-ddATP | Enzo Biosciences | 42809 |
Table 1. Specific reagents and equipment.
References
- Tietjen, I. Single-cell transcriptional analysis of neuronal progenitors. Neuron. 38, 161-175 (2003).
- Trimarchi, J. M. Molecular heterogeneity of developing retinal ganglion and amacrine cells revealed through single cell gene expression profiling. J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).
- Trimarchi, J. M., Cho, S. H., Cepko, C. L. Identification of genes expressed preferentially in the developing peripheral margin of the optic cup. Dev. Dyn. 238, 2327-2327 (2009).
- Cherry, T. J., Trimarchi, J. M., Stadler, M. B., Cepko, C. L. Development and diversification of retinal amacrine interneurons at single cell resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9495-9500 (2009).
- Roesch, K. The transcriptome of retinal Muller glial cells. J. Comp. Neurol. 509, 225-238 (2008).
- Ramos, C. A. Evidence for diversity in transcriptional profiles of single hematopoietic stem cells. PLoS Genet. 2, e159 (2006).
- Chiang, M. K., Melton, D. A. Single-cell transcript analysis of pancreas development. Dev. Cell. 4, 383-393 (2003).
- Trimarchi, J. M., Stadler, M. B., Cepko, C. L. Individual retinal progenitor cells display extensive heterogeneity of gene expression. PLoS ONE. 3, e1588 (2008).
- Nelson, S. B., Sugino, K., Hempel, C. M. The problem of neuronal cell types: a physiological genomics approach. Trends Neurosci. 29, 339-345 (2006).
- Stevens, C. F. Neuronal diversity: too many cell types for comfort. Curr. Biol. 8, R708-R710 (1998).
- Cepko, C. L., Austin, C. P., Yang, X., Alexiades, M., Ezzeddine, D. Cell fate determination in the vertebrate retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 589-595 (1996).
- Kim, D. S. Identification of molecular markers of bipolar cells in the murine retina. J. Comp. Neurol. 507, 1795-1810 (2008).
- Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453, 544-547 (2008).
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Gene expression and the myth of the average cell. Trends Cell Biol. 13, 4-6 (2003).
- Livesey, F. J., Cepko, C. L. Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina. Nat. Rev. Neurosci. 2, 109-118 (2001).
- Masland, R. H., Raviola, E. Confronting complexity: strategies for understanding the microcircuitry of the retina. Annu. Rev. Neurosci. 23, 249-284 (2000).
- Blackshaw, S. Genomic analysis of mouse retinal development. PLoS Biol. 2, e247 (2004).
- Livesey, F. J., Young, T. L., Cepko, C. L. An analysis of the gene expression program of mammalian neural progenitor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1374-1379 (2004).
- Chowers, I. Identification of novel genes preferentially expressed in the retina using a custom human retina cDNA microarray. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 3732-3741 (2003).
- Clarke, G. C., Leavitt, R. A., Andrews, B. R., Hayden, D. F., Lumsden, M. R., J, C., McInnes, R. R. A one-hit model of cell death in inherited neuronal degenerations. Nature. 406, 195-199 (2000).
- McEvoy, J. F. -. O., Zhang, J., Nemeth, J., Brennan, K., Bradley, R., Krafcik, C., Rodriguez-Galindo, F., Wilson, C., Xiong, M., Lozano, S. Coexpression of normally incompatible developmental pathways in retinoblastoma genesis. Cancer Cell. 20, 260-275 (2011).
- Gelder, R. N. V. a. n. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1663-1667 (1990).
- Ginsberg, S. D., Che, S. Expression profile analysis within the human hippocampus: comparison of CA1 and CA3 pyramidal neurons. J. Comp. Neurol. 487, 107-118 (2005).
- Iscove, N. N. Representation is faithfully preserved in global cDNA amplified exponentially from sub-picogram quantities of mRNA. Nat. Biotechnol. 20, 940-943 (2002).
- Subkhankulova, T., Livesey, F. J. Comparative evaluation of linear and exponential amplification techniques for expression profiling at the single-cell level. Genome Biol. 7, R18 (2006).
