単一網膜細胞およびそれらのcDNAのその後の増幅を単離するための方法が説明されています。単一細胞トランスクリプトーム組織内に存在する細胞の不均質性の程度を明らかにし、まれな細胞集団の新たなマーカー遺伝子を発見します。付随するプロトコルは、多くの異なる種類の細胞に合わせて調整することができます。
細胞の高度に専門化が、非常に小さな集団が多くの組織で重要な役割を果たしている。非常にまれな細胞サブセットの細胞型特異的マーカーと遺伝子発現プログラムの識別は、標準的な全体の組織のアプローチを使用して挑戦されています。個々の細胞の遺伝子発現プロファイリングは、全組織1-7のわずかな割合を構成する細胞の種類に前例のないアクセスを可能にします。さらに、この手法は、一時的に8の動的発達遷移中に細胞の小さな数字で表現される遺伝子発現のプログラムを調べるために使用することができます。
携帯電話の多様性のこの問題は、ニューロンの接続が非常に多様な細胞が9との間に発生する可能性があり、中枢神経系(CNS)で繰り返し発生します。異なる種類の細胞の正確な数は正確に知られていないですが、それは皮質私のように多くの1000などの異なるタイプが存在する可能性があることと推定されているtself 10。複雑な神経回路の機能(s)はまれな神経細胞の種類とそれらが発現する遺伝子の一部に依存する場合があります。新しいマーカーを同定し、分子の異なるニューロンを分類するために助けることによって、単一セルのアプローチは、神経系の細胞型の解析に特に有用である。それはまた、神経前駆開発の初期段階で示差的に発現する遺伝子や遺伝子経路を識別することによって、神経発生のメカニズムを解明するのに役立つ可能性があります。
かなりの神経細胞の多様性を持つ単純な、簡単にアクセス組織として、脊椎動物の網膜は、細胞の開発、神経分化と神経多様化のプロセスを研究するための優れたモデルシステムです。しかし、中枢神経系の他の部分のように、この細胞の多様性は、特に桿体は、MAを作ることを考えると、特定の細胞の運命を採用する網膜前駆細胞を駆動する遺伝的経路を決定するための問題を提示することができ合計網膜細胞集団11のjority。ここでは、単一網膜細胞( 図1)で表される転写産物を同定するための方法を報告します。単一細胞のプロファイリング技術は、網膜2,4,5,12の異なる細胞集団内の異質性の存在量の評価が可能になります。さらに、このメソッドは、細胞の運命は、網膜前駆細胞のサブセット8で発生するプロセスを意思決定の役割(複数可)を果たす可能性がある新たな候補遺伝子の宿主を明らかにした。プロトコルにはいくつかの簡単な調整で、このテクニックは、多くの異なる組織および細胞型に利用することができる。
研究の拡大を続ける数は、その遺伝子発現6,8に関してより均一であると考えられていた集団での強固な細胞間の変動を明らかにしています。少なくとも一つのインスタンスで、この遺伝子発現の"ノイズ"が重要な生物学的機能13を果たすことが示されている。個々の細胞間の遺伝子発現の違いは、伝統的な全体の組織の方法を使用して隠されている。これらの実験は、?…
The authors have nothing to disclose.
Reaction mixtures:
Cell Lysis buffer
0.45 μ | 10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2) |
0.23 μl | 10% NP-40 |
0.23 μl | 0.1M DTT |
0.05 μl | RNase Inhibitor (40 U/μl) |
0.05 μl | SUPERase-In (20U/μl) |
0.13 μl | Modified Oligo d(T) primer (TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT) |
0.09 μl | dNTPs (2.5 mM each) |
3.27 μl | dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures) |
Tailing Reaction Mixture
0.18 μl | 100 mM dATP |
0.6 μl | 10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2) |
4.62 μl | dH2O |
0.3 μl | TdT (400 U/μl) |
0.3 μl | RNase H (2 U/μl) |
PCR Reaction Mixture
10 μl | 10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+ |
10 μl | 2.5 mM dNTPs |
0.2 μl | Modified Oligo d(T) primer (10 μg/μl) |
1 μl | Ex-Taq HS Polymerase (5U/μl) |
68.8 μl | dH2O |
10X One-Phor All Buffer
0.5M | Potassium acetate |
0.1M | Tris acetate (pH 7.6) |
0.1M | Magnesium acetate |
Solutions:
10X Phosphate buffered saline (1 liter)
80g NaCl
2g KCl
14.4 g Na2PO4
2.4 g KH2PO4
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Vertical needle puller | David Kopf Instruments | Model 750 | |
Microcapillary tubes | Sigma | P0674 | |
Aspirator tube assembly | Sigma | A5177 | |
Corning filter tips (100-1000 μl | Fisher Scientific | 07-200-265 | |
Hank’s balanced salt solution (1X) | Lonza BioWhittaker | 10-508F | |
HEPES buffer (1M) | MP Biomedicals | 091688449 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
DNase I | Roche | 04716728001 | |
papain | Worthington | LS03126 | |
Superscript III | Invitrogen | 18080-044 | |
RNase Inhibitor | Applied Biosystems | AM2682 | These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear. |
SUPERase-In | Applied Biosystems | AM2694 | These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear. |
Modified Oligo d(T) primer (gel purified) | Oligos ETC | We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC. | |
T4 gene 32 protein | New England Biolabs | M0300L | |
Exonuclease I | New England Biolabs | M0293S | |
TdT | Roche | 3 333 574 | As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results. |
RNase H | Invitrogen | 18021-014 | |
Ex-Taq HS Polymerase | Takara | RR006A | |
Biotin N6-ddATP | Enzo Biosciences | 42809 |
Table 1. Specific reagents and equipment.