Une seule cellule de profilage de développer et d'âge mûr neurones de la rétine

Summary

Procédé pour l'isolement de cellules rétiniennes uniques et d'amplification ultérieur de leurs ADNc est décrite. Monocellulaires transcriptomique révèle le degré de l'actuelle hétérogénéité cellulaire dans un tissu et découvre de nouveaux gènes marqueurs de populations de cellules rares. Le protocole d'accompagnement peut être ajustée en fonction de nombreux types cellulaires différents.

Abstract

Populations hautement spécialisés, mais extrêmement faible de cellules jouent un rôle important dans de nombreux tissus. L'identification de la cellule de type marqueurs spécifiques et des programmes d'expression génique pour des sous-ensembles de cellules extrêmement rares a été un défi en utilisant des tissus entiers approches. Profilage de l'expression génique des cellules individuelles permet un accès sans précédent à des types cellulaires qui composent seulement un petit pourcentage de l'ensemble du tissu ^1-7. En outre, cette technique peut être utilisée pour examiner les programmes de l'expression des gènes qui sont exprimés dans transitoirement un petit nombre de cellules au cours de dynamiques de développement des transitions ^8.

Cette question de la diversité cellulaire se pose à plusieurs reprises dans le système nerveux central (SNC) où les connexions neuronales peuvent se produire entre les cellules très diverses ^9. Le nombre exact de types cellulaires distincts n'est pas connue avec précision, mais il a été estimé qu'il pourrait y avoir jusqu'à 1000 différents types dans le cortex itself ^10. La fonction (s) de circuits neuronaux complexes peut s'appuyer sur quelques-uns des types rares neurones et les gènes qu'ils expriment. En identifiant de nouveaux marqueurs et d'aider à classer les différents neurones moléculaire, l'approche unique de cellules est particulièrement utile dans l'analyse des types de cellules dans le système nerveux. Il peut aussi aider à élucider les mécanismes de développement du système nerveux par l'identification des gènes différentiellement exprimés et les voies de gènes au cours des étapes précoces du développement progéniteur neuronal.

En simple, le tissu facilement accessible avec la diversité neuronale considérable, la rétine des vertébrés est un excellent modèle pour étudier les processus de développement cellulaire, la différenciation neuronale et la diversification neuronale. Cependant, comme dans d'autres parties du système nerveux central, cette diversité cellulaire peut présenter un problème pour la détermination des voies génétiques qui conduisent progéniteurs rétiniens d'adopter un destin cellulaire spécifique, en particulier étant donné que les photorécepteurs tige forment le majorité de la population totale des cellules rétiniennes ^11. Nous rapportons ici une méthode pour l'identification des transcrits exprimés dans les cellules rétiniennes simples (figure 1). La technique de profilage à cellule unique permet pour l'évaluation de la quantité de l'hétérogénéité au sein de différentes populations cellulaires de la rétine ^2,4,5,12. En outre, cette méthode a révélé une foule de nouveaux gènes candidats qui pourraient jouer un rôle (s) dans le destin des cellules aux processus décisionnels qui se produisent dans des sous-ensembles de cellules progénitrices rétiniennes ^8. Avec quelques ajustements simples du protocole, cette technique peut être utilisée pour de nombreux tissus différents et des types de cellules.

Protocol

1. Dissociation cellulaire Un organigramme décrivant le protocole qui est affiché est la figure 1. Pour les numéros de catalogue des réactifs particuliers utilisés dans le présent protocole, s'il vous plaît se référer au tableau 1. Disséquer la rétine dans un bain de PBS. Lors de la dissection, il est préférable d'enlever le vitré et la lentille depuis les garder avec la rétine peuvent entraver la dissociation. Il n'est pas toujours une importance c…

Discussion

Un nombre sans cesse croissant d'études révèlent robustes cellule à cellule variabilité des populations que l'on croyait à être plus homogènes en ce qui concerne leur expression génique ^6,8. Dans un cas au moins, cette expression du gène du «bruit» a été montré à jouer un rôle important biologique ^13. Différences d'expression des gènes entre les cellules individuelles sont obscurcies à l'aide de tissus traditionnels ensemble des méthodes. Ces expériences de gé…

Materials

Reaction mixtures:

Cell Lysis buffer

0.45 μ	10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)
0.23 μl	10% NP-40
0.23 μl	0.1M DTT
0.05 μl	RNase Inhibitor (40 U/μl)
0.05 μl	SUPERase-In (20U/μl)
0.13 μl	Modified Oligo d(T) primer (TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)
0.09 μl	dNTPs (2.5 mM each)
3.27 μl	dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures)

Tailing Reaction Mixture

0.18 μl	100 mM dATP
0.6 μl	10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)
4.62 μl	dH2O
0.3 μl	TdT (400 U/μl)
0.3 μl	RNase H (2 U/μl)

PCR Reaction Mixture

10 μl	10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+
10 μl	2.5 mM dNTPs
0.2 μl	Modified Oligo d(T) primer (10 μg/μl)
1 μl	Ex-Taq HS Polymerase (5U/μl)
68.8 μl	dH2O

10X One-Phor All Buffer

0.5M	Potassium acetate
0.1M	Tris acetate (pH 7.6)
0.1M	Magnesium acetate

Solutions:

10X Phosphate buffered saline (1 liter)

80g NaCl
2g KCl
14.4 g Na₂PO₄
2.4 g KH₂PO₄
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
Vertical needle puller	David Kopf Instruments	Model 750
Microcapillary tubes	Sigma	P0674
Aspirator tube assembly	Sigma	A5177
Corning filter tips (100-1000 μl	Fisher Scientific	07-200-265
Hank’s balanced salt solution (1X)	Lonza BioWhittaker	10-508F
HEPES buffer (1M)	MP Biomedicals	091688449
Bovine serum albumin	Sigma	A9418
DNase I	Roche	04716728001
papain	Worthington	LS03126
Superscript III	Invitrogen	18080-044
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	AM2682	These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.
SUPERase-In	Applied Biosystems	AM2694	These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.
Modified Oligo d(T) primer (gel purified)	Oligos ETC		We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC.
T4 gene 32 protein	New England Biolabs	M0300L
Exonuclease I	New England Biolabs	M0293S
TdT	Roche	3 333 574	As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results.
RNase H	Invitrogen	18021-014
Ex-Taq HS Polymerase	Takara	RR006A
Biotin N6-ddATP	Enzo Biosciences	42809

Table 1. Specific reagents and equipment.