Una sola célula de perfiles de neuronas de la retina en desarrollo y maduro

Summary

Un método para el aislamiento de células de la retina individuales y la amplificación posterior de sus ADNc se describe. Una sola célula de la transcriptómica revela el grado de heterogeneidad presente celular en un pañuelo de papel y descubre nuevos genes marcadores de poblaciones celulares raras. El protocolo de acompañamiento se puede ajustar para adaptarse a diferentes tipos de células.

Abstract

Poblaciones altamente especializados, pero muy pequeña de células juegan un papel importante en muchos tejidos. La identificación de células de tipo de marcadores específicos y programas de expresión génica para subconjuntos de células muy raras ha sido un reto con estándar de tejidos de todo el enfoque. Perfiles de expresión génica de las células individuales permite un acceso sin precedentes a los tipos de células que comprenden sólo un pequeño porcentaje del total del tejido ^1-7. Además, esta técnica puede utilizarse para examinar los programas de expresión génica que se transitoriamente expresados ​​en un pequeño número de células durante las transiciones dinámicas de desarrollo ^8.

Este tema de la diversidad celular surge repetidamente en el sistema nervioso central (SNC), donde las conexiones neuronales puede ocurrir entre células muy diversos ^9. El número exacto de distintos tipos de células que no se conoce con precisión, pero se ha estimado que puede haber hasta 1.000 tipos diferentes de la corteza itself ^10. La función (s) de los complejos circuitos neuronales puede confiar en algunos de los tipos raros neuronales y los genes que expresan. Al identificar nuevos marcadores y ayudando a clasificar molecularmente diferentes neuronas, el enfoque de una sola célula es particularmente útil en el análisis de tipos de células en el sistema nervioso. También puede ayudar a dilucidar los mecanismos de desarrollo neuronal mediante la identificación de genes expresados ​​diferencialmente y vías genéticas durante las primeras etapas del desarrollo neuronal progenitora.

Como un pañuelo de papel simple, de fácil acceso a la diversidad neuronal considerable, la retina de los vertebrados es un excelente sistema modelo para estudiar los procesos de desarrollo celular, la diferenciación neuronal y la diversificación de las neuronas. Sin embargo, como en otras partes del sistema nervioso central, esta diversidad celular puede presentar un problema para la determinación de las vías genéticas que conducen a la retina progenitores a adoptar un destino específico de célula, sobre todo teniendo en cuenta que fotorreceptores de los bastones conforman el mayoría de la población total de células de retina ^11. Aquí se presenta un método para la identificación de las transcripciones expresadas en células de la retina individuales (Figura 1). La técnica del perfil de una sola célula permite la evaluación de la cantidad presente de la heterogeneidad dentro de las diferentes poblaciones celulares de la retina, ^2,4,5,12. Además, este método ha revelado una gran cantidad de nuevos genes candidatos que pueden jugar un papel (s) en el destino de la célula de toma de decisiones que se producen en la población de células progenitoras de la retina ^8. Con algunos ajustes sencillos para el protocolo, esta técnica puede ser utilizada para diferentes tejidos y tipos de células.

Protocol

1. La disociación de la célula Un diagrama de flujo delineando el protocolo que se muestra es la Figura 1. Para los números de catálogo de los reactivos particulares utilizados en este protocolo, por favor refiérase a la Tabla 1. Disección de la retina en un baño de PBS. Durante la disección, lo mejor es eliminar el vítreo y el cristalino ya que mantener con la retina puede impedir la disociación. No siempre es críticamente importante para eliminar todo el epitelio…

Discussion

Un número cada vez mayor de los estudios están revelando robusta célula a célula de la variabilidad en las poblaciones que se creían ser más homogéneos en cuanto a su expresión de genes ^6,8. En al menos un caso, esta expresión de los genes "ruido" se ha demostrado que desempeña una importante función biológica ^13. Las diferencias de expresión génica entre las células individuales se oculta utilizando tejidos tradicionales de todo el método. Estos experimentos generar el pe…

Materials

Reaction mixtures:

Cell Lysis buffer

0.45 μ	10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)
0.23 μl	10% NP-40
0.23 μl	0.1M DTT
0.05 μl	RNase Inhibitor (40 U/μl)
0.05 μl	SUPERase-In (20U/μl)
0.13 μl	Modified Oligo d(T) primer (TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)
0.09 μl	dNTPs (2.5 mM each)
3.27 μl	dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures)

Tailing Reaction Mixture

0.18 μl	100 mM dATP
0.6 μl	10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)
4.62 μl	dH2O
0.3 μl	TdT (400 U/μl)
0.3 μl	RNase H (2 U/μl)

PCR Reaction Mixture

10 μl	10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+
10 μl	2.5 mM dNTPs
0.2 μl	Modified Oligo d(T) primer (10 μg/μl)
1 μl	Ex-Taq HS Polymerase (5U/μl)
68.8 μl	dH2O

10X One-Phor All Buffer

0.5M	Potassium acetate
0.1M	Tris acetate (pH 7.6)
0.1M	Magnesium acetate

Solutions:

10X Phosphate buffered saline (1 liter)

80g NaCl
2g KCl
14.4 g Na₂PO₄
2.4 g KH₂PO₄
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
Vertical needle puller	David Kopf Instruments	Model 750
Microcapillary tubes	Sigma	P0674
Aspirator tube assembly	Sigma	A5177
Corning filter tips (100-1000 μl	Fisher Scientific	07-200-265
Hank’s balanced salt solution (1X)	Lonza BioWhittaker	10-508F
HEPES buffer (1M)	MP Biomedicals	091688449
Bovine serum albumin	Sigma	A9418
DNase I	Roche	04716728001
papain	Worthington	LS03126
Superscript III	Invitrogen	18080-044
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	AM2682	These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.
SUPERase-In	Applied Biosystems	AM2694	These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.
Modified Oligo d(T) primer (gel purified)	Oligos ETC		We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC.
T4 gene 32 protein	New England Biolabs	M0300L
Exonuclease I	New England Biolabs	M0293S
TdT	Roche	3 333 574	As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results.
RNase H	Invitrogen	18021-014
Ex-Taq HS Polymerase	Takara	RR006A
Biotin N6-ddATP	Enzo Biosciences	42809

Table 1. Specific reagents and equipment.