Encellet Profiling for å utvikle og modne Retinal Neurons

Summary

En metode for isolering av single netthinnens celler og påfølgende forsterkning av deres cDNAs er beskrevet. Encellede transcriptomics avslører graden av cellulær heterogenitet stede i en vev og avdekker nye markør gener for sjeldne celle populasjoner. Den medfølgende protokollen kan tilpasses mange forskjellige celletyper.

Abstract

Høyt spesialiserte, men overmåte små populasjoner av celler spiller viktige roller i mange vev. Identifiseringen av celle-type spesifikke markører og genuttrykk programmer for ekstremt sjeldne celle undergrupper har vært en utfordring ved bruk av standard hel-vev tilnærminger. Genuttrykk profilering av individuelle celler gir enestående tilgang til celletyper som utgjør bare en liten prosentandel av det totale vev ^1-7. I tillegg kan denne teknikken brukes til å undersøke genekspresjon programmene som er forbigående uttrykt i små antall celler under dynamiske utvikling overganger ^8.

Denne utgaven av mobilnettet mangfold oppstår gjentatte ganger i det sentrale nervesystemet (CNS), hvor nevrale forbindelser kan forekomme mellom ganske ulike celler ^9. Det nøyaktige antallet distinkte celletyper er ikke nøyaktig kjent, men det har blitt anslått at det kan være så mange som 1000 forskjellige typer i cortex itself ^10. Funksjonen (e) av komplekse nevrale kretser kan stole på noen av de sjeldne nevrale typene og hvilke gener de uttrykker. Ved å identifisere nye markører og bidra til å molecularly klassifisere ulike nerveceller, er encellede tilnærming spesielt nyttig i analysen av celletyper i nervesystemet. Det kan også bidra til å belyse mekanismene for nevral utvikling ved å identifisere differensielt uttrykte gener og gen veier under tidlige stadier av nevronale stamceller utvikling.

Som en enkel, lett tilgjengelig vev med betydelig neuronal mangfold, er virveldyr netthinnen en utmerket modellsystem for å studere prosessene i mobilnettet utvikling, neuronal differensiering og nevronale diversifisering. Men som i andre deler av CNS, kan dette mobilnettet mangfoldet presentere et problem for å bestemme de genetiske mekanismer som driver netthinnens stamfedre til å vedta en bestemt celle skjebne, spesielt på grunn av at Rod fotoreseptorene utgjør majority av den totale retinal cellen befolkning ^11. Her rapporterer vi en metode for identifisering av vitnemål uttrykt i enkle netthinnens celler (figur 1). Den encellede profilering teknikk åpner for vurdering av mengden av heterogenitet stede innenfor ulike cellulære bestander av netthinnen ^2,4,5,12. I tillegg har denne metoden avdekket en rekke nye kandidat gener som kan spille rollen (e) i cellen skjebne beslutningsprosessene som skjer i undergrupper av netthinnens stamceller ^8. Med noen enkle justeringer i protokollen, kan denne teknikken brukes til mange forskjellige vev og celletyper.

Protocol

1. Cell Dissosiasjon Et flytdiagram som beskriver protokollen vises er Figur 1. For katalog tallene for de spesielle reagenser som brukes i denne protokollen, se tabell 1. Dissekere netthinnen i en PBS bad. Under disseksjonen, er det best å fjerne glasslegemet og linsen siden holde dem med netthinnen kan hindre dissosiasjon. Det er ikke alltid kritisk viktig å fjerne alt av retinal pigment epitelet (RPE) og i noen tilfeller kan det være umulig å fjerne det. Men for encell…

Discussion

Et stadig voksende antall studier er avslørende robust celle-til-celle variasjon i populasjoner som ble antatt å være mer homogen med hensyn til deres genuttrykk ^6,8. I minst ett tilfelle har dette genet uttrykket "støy" vist seg å spille en viktig biologisk funksjon ^13. Genekspresjon forskjeller mellom de enkelte cellene er skjult ved hjelp av tradisjonelle hel-vev metoder. Disse eksperimentene generere uttrykk profilen en "gjennomsnittlig" celle, som kanskje ikke er repre…

Materials

Reaction mixtures:

Cell Lysis buffer

0.45 μ	10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)
0.23 μl	10% NP-40
0.23 μl	0.1M DTT
0.05 μl	RNase Inhibitor (40 U/μl)
0.05 μl	SUPERase-In (20U/μl)
0.13 μl	Modified Oligo d(T) primer (TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)
0.09 μl	dNTPs (2.5 mM each)
3.27 μl	dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures)

Tailing Reaction Mixture

0.18 μl	100 mM dATP
0.6 μl	10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)
4.62 μl	dH2O
0.3 μl	TdT (400 U/μl)
0.3 μl	RNase H (2 U/μl)

PCR Reaction Mixture

10 μl	10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+
10 μl	2.5 mM dNTPs
0.2 μl	Modified Oligo d(T) primer (10 μg/μl)
1 μl	Ex-Taq HS Polymerase (5U/μl)
68.8 μl	dH2O

10X One-Phor All Buffer

0.5M	Potassium acetate
0.1M	Tris acetate (pH 7.6)
0.1M	Magnesium acetate

Solutions:

10X Phosphate buffered saline (1 liter)

80g NaCl
2g KCl
14.4 g Na₂PO₄
2.4 g KH₂PO₄
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
Vertical needle puller	David Kopf Instruments	Model 750
Microcapillary tubes	Sigma	P0674
Aspirator tube assembly	Sigma	A5177
Corning filter tips (100-1000 μl	Fisher Scientific	07-200-265
Hank’s balanced salt solution (1X)	Lonza BioWhittaker	10-508F
HEPES buffer (1M)	MP Biomedicals	091688449
Bovine serum albumin	Sigma	A9418
DNase I	Roche	04716728001
papain	Worthington	LS03126
Superscript III	Invitrogen	18080-044
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	AM2682	These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.
SUPERase-In	Applied Biosystems	AM2694	These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.
Modified Oligo d(T) primer (gel purified)	Oligos ETC		We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC.
T4 gene 32 protein	New England Biolabs	M0300L
Exonuclease I	New England Biolabs	M0293S
TdT	Roche	3 333 574	As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results.
RNase H	Invitrogen	18021-014
Ex-Taq HS Polymerase	Takara	RR006A
Biotin N6-ddATP	Enzo Biosciences	42809

Table 1. Specific reagents and equipment.