Summary

Trazado de Circuitos Viral genéticamente definidos Neural

Published: October 17, 2012
doi:

Summary

Un método de rastreo de neuronas conectadas sinápticamente se describe. Usamos especificidad TVA de una célula de aguas arriba para probar si una población celular de interés recibe la entrada sináptica de tipos de células genéticamente definidos.

Abstract

Los métodos clásicos para el estudio de los circuitos neuronales están rendimiento bastante bajo. Transsynaptic virus, particularmente la pseudorrabia (PRV) y virus de la rabia (RABV), y más recientemente virus de la estomatitis vesicular (VSV), para el estudio de circuitos, es cada vez más popular. Estos métodos de rendimiento más altos utilizan virus que transmiten entre las neuronas, ya sea en la dirección anterógrada o retrógrada.

Recientemente, un RABV modificado para monosináptico retrógrada rastreo fue desarrollado. (Figura 1A). En este método, la glicoproteína (G) de genes se elimina del genoma viral, y reabastecidos sólo en las neuronas específicas. Especificidad infección se logra mediante la sustitución de una G quimérico, formado por el dominio extracelular de la glicoproteína ASLV-A y el dominio citoplásmico de la RABV-G (A / RG), para el normal RABV-G 1. Este G quimérica específicamente infecta las células que expresan el receptor TVA 1. El gen que codifica TVA puede sido delivered por diversos métodos 2-8. Tras RABV-G infección de una neurona TVA-expresando, el RABV puede transmitir a otras neuronas, conectadas sinápticamente en una dirección retrógrada por la naturaleza de su propio G que fue cosuministrado con el receptor de TVA. Esta técnica etiqueta un número relativamente grande de entradas (5-10%) 2 en un tipo celular definido, proporcionando un muestreo de todas las entradas en un tipo de célula de arranque definido.

Recientemente hemos modificado esta técnica a utilizar VSV como un trazador transsynaptic 9. VSV tiene varias ventajas, incluyendo la rapidez de la expresión génica. A continuación detallamos un nuevo sistema de rastreo viral utilizando útiles para sondear microcircuitos con mayor resolución VSV. Mientras que las estrategias original publicado por Wickersham et al. 4 y Beier et al. 9 permiso de etiquetado de cualquier neuronas que se proyectan hacia inicialmente infectado-TVA-expresando células, aquí VSV fue diseñado para transmitir sólo a TVCélulas que expresan A-(Figura 1B). El virus es primero pseudotyped con RABV-G para permitir la infección de aguas abajo de las neuronas que expresan TVA neuronas. Después de infectar esta primera población de células, el virus liberado sólo pueden infectar células que expresan TVA. Debido a la propagación viral transsynaptic se limita a las células que expresan TVA, la presencia de ausencia de la conectividad de los tipos de células definidos pueden ser explorados con alta resolución. Un diagrama de flujo experimental de estos experimentos se muestra en la Figura 2. Aquí se muestra un circuito de modelo, el de la dirección de selectividad en la retina del ratón. Se examina la conectividad de las células amacrinas starburst (ZEC) a las células ganglionares de la retina (CGR).

Protocol

1. Haciendo Virus de cDNA: Recuperación de VSV de cDNA utilizando la vacuna-T7 System 10 Un día antes del experimento, dividir BsrT7 células en placa de 60 mm que contiene DMEM + 10% de FBS. Semillas 2E6 células por placa. BsrT7 células se derivan de BHK21, o riñón de cría de hámster, células. PBS caliente con magnesio 1 mM y 1 mM de calcio a 37 ° C. Obtener una pequeña alícuota vTF7-3, un virus vaccinia que expresa la polimerasa T7, y descongelación a temperatura …

Discussion

Uso de virus para estudiar circuitos neuronales es un método de rendimiento relativamente alto de analizar neuronas conectadas. Sin embargo, generar tanto VSV y viriones RABV no es trivial. Aunque el protocolo enumerados anteriormente para el virus de rescate a partir de ADNc se proporciona, todavía es un evento de baja probabilidad. Los niveles de cada uno de los N, P, L y plásmidos necesitan ser ajustado con precisión, ya que muchos ensayos y replica necesita hacer para asegurar rescate viral. La formación de la …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría reconocer Sean Whelan para obtener ayuda con el rescate de las variantes recombinantes VSV y Didem Goz y Chrenek Ryan de asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por el HHMI (CLC), y # NS068012-01 (KTB).

Materials

Reagent Company Catalogue number  
      Tissue Culture
Baby Hamster Kidney (BSRT7) cells available upon request    
vaccinia (vTF7-3) available upon request    
pN, pP, pl plasmids available upon request    
Calcium Chloride Sigma C1016  
Magnesium Chloride Sigma M8266  
HEK 293T cells Open Biosystems HCL4517  
60 mm TC-Treated Culture Dish Corning 430166  
75 cm2 Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap Corning 430641  
Media : DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) Invitrogen 12491-015  
1 M HEPES pH 7.4 Gibo 15630-080  
FBS: Fetal Bovine Serum Gibco 10437-028  
PKS Invitrogen 15140-163  
Lipofectamine 2,000 Transfection Reagent Invitrogen 11668-019  
Syringe: 5 ml Luer-Lock syringe Sigma Z248010-1PAK  
Syringe Filters Nalgene 190-2520  
PEI: High Potency Linear PEI Polysciences 23966  
      Viral Centrifugation
Corning 150 ml Tube Top Vacuum Filter System, 0.45 μm Pore Corning 430314  
Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 ml, 25 x 89 mm ultracentrifuge tubes Beckman-Coulter 344058  
Ultracentrifuge Beckman-Coulter optima XL-80K  
SW28 Ultracentrifuge rotor Beckman-Coulter 342207  
      Mouse Injection
Capillary micropipets Drummond 5-000-2005  
Stereotax Narishige SR-5M  
Micromanipulator Narishige SM-15  
Ump injector World Precision Instruments Sys-Micro4  
Four channel microcontroller World Precision Instruments UMP3  
M.TXB Bench Motor with C.EMX-1 Dial Control, 115 Volt Foredom M.TXB-EM  
H.10 Handpiece, Quick Change Foredom H.10  
Step Drill, 0.5 mm Foredom A-58005P  
Microelectrode holder World Precision Instruments MEH2S  
Ketamine Henry Schein 995-2949  
Xylazine Henry Schein 4015809TV  
Buprenorphine Henry Schein 1118217  
1 ml syringe Becton-Dickinson 309628  
30 gauge injection needle Becton-Dickinson 305106  
Protective Ophthalmic Ointment Doctors Foster and Smith 9N-014748  
Ethanol Sigma 493511  
Iodine Sigma PVP1  
      Surgery and Dissection tools
Scissors Fine Science Tools 91402-12  
Standard Forceps Fine Science Tools 11000-12  
Fine Forceps Fine Science Tools 11255-20  
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-00  
Scalpel handle Fine Science Tools 10003-12  
Scalpel blades Fine Science Tools 10015-00  
Sutures Robbins Instruments 20.SK640  
      Dissection and antibody staining
paraformaldehyde Sigma P6148  
Phosphate Buffered Saline Sigma P4417  
Triton X-100 Sigma T9284  
Donkey Serum Jackson Immunoresearch 017-000-121  
      Antibodies
Antibodies millipore AB144P  
Anti-gfp Abcam ab13970  
Donkey anti-chicken Dylight 488 Jackson immunoresearch 703-545-155  
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647 Jackson immunoresearch 705-605-147  
DAPI Invitrogen D1306  
      Tissue mounting
Superfrost plus microscope slides Fisher 12-550-100  
Cover glass 22 x 22, 0 thickness Electron Microscopy Sciences 72198-10  
Silicone elastomer Rogers Corp HT-6220  
Clear nail polish Electron Microscopy Sciences 72180  
Prolong Gold antifade reagent Invitrogen P36930  

References

  1. Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
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Cite This Article
Beier, K., Cepko, C. Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry. J. Vis. Exp. (68), e4253, doi:10.3791/4253 (2012).

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