Summary

Вирусный отслеживание генетически определенных нервной системы

Published: October 17, 2012
doi:

Summary

Метод трассировки синаптически связанных нейронов описано. Мы используем TVA специфику вверх клетки, чтобы исследовать, является ли клетка интерес населения получает синаптические вход из генетически определены типы клеток.

Abstract

Классические методы для изучения нейронных цепей довольно низкой пропускной способностью. Транссинаптических вирусов, в частности, псевдобешенства (PRV) и вирус бешенства (RABV), а в последнее время вирус везикулярного стоматита (VSV), для изучения схемы, становится все более популярным. Эти методы более высокого пропускная способность использовать вирусы, которые передают между нейронами либо в антероградной или обратном направлении.

Недавно измененные RABV для моносинаптических ретроградной трассировка была разработана. (Рис. 1А). В этом методе, гликопротеин (G) гена будет удален из вирусного генома, и снабжение только в целевых нейронов. Инфекция специфики достигается путем замещения химерных G, состоящий из внеклеточного домена ASLV-гликопротеина и цитоплазматический домен RABV-G (A / RG), для нормального RABV-G 1. Это химерных G специально заражает клетки, экспрессирующие рецептор TVA 1. Ген, кодирующий TVA можно было Delivered с помощью различных методов 2-8. После RABV G-инфекции TVA-экспрессирующих нейронов, RABV может передать другим, синаптически связанных нейронов в обратном направлении по природе своей G которая была совместно поставляется с рецептором TVA. Этот метод называет сравнительно большое число входов (5-10%) 2 на определенный тип клеток, обеспечивая выборку всех входов на определенный тип клеток стартера.

Мы недавно измененные эту технику, чтобы использовать VSV как транссинаптических индикатора 9. VSV имеет ряд преимуществ, в том числе скорость экспрессии генов. Здесь мы подробно новых вирусных система отслеживания использования VSV полезно для зондирования микросхемы с повышенным разрешением. Хотя первоначально опубликованных стратегий Wickersham и соавт. 4 и Beier и др. 9. Разрешение маркировки любых нейронов, которые проецируются на первично-инфицированных TVA-выражение-клетки, здесь VSV был разработан для передачи только на ТВ-Экспрессирующие клетки (рис. 1б). Вирус сначала pseudotyped с RABV-G, чтобы позволить инфекции нейронов вниз по течению от TVA-экспрессирующих нейронов. После заражения этой первой популяции клеток, вирус выпущен только заразить TVA-экспрессирующих клеток. Потому что транссинаптических вирусное распространение ограничено TVA-экспрессирующих клеток, наличие или отсутствие подключения от определенных типов клеток могут быть изучены с высоким разрешением. Экспериментальная схема этих экспериментах показано на рисунке 2. Здесь мы покажем модель цепи, что направление селективности в сетчатке мышей. Мы рассматриваем возможность подключения звездообразования клетки амакринные (SAC) в ганглиозных клеток сетчатки (РГК).

Protocol

1. Оформление Вирус из кДНК: Восстановление VSV из кДНК с использованием коровьей-T7 системы 10 За день до эксперимента, разделить BsrT7 клеток в 60 мм блюдо с DMEM + 10% FBS. Семенной 2E6 клеток на чашку. BsrT7 клетки получают из BHK21, или ребенка хомяк почек, клеток. Теплый PBS с 1 магний мм и 1…

Discussion

Использование вирусов для изучения нейронных цепей является относительно высокая пропускная способность метод анализа связной нейронов. Однако, создавая как VSV и RABV вирионы не является тривиальной. Хотя протокол, перечисленные выше для спасения вируса из ДНК, то она по-прежнему низко?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить Шон Уилан за помощь в спасении рекомбинантные варианты VSV, и Didem Гоз и Райан Chrenek для оказания технической помощи. Эта работа была поддержана HHMI (CLC), и # NS068012-01 (КТБ).

Materials

Reagent Company Catalogue number  
      Tissue Culture
Baby Hamster Kidney (BSRT7) cells available upon request    
vaccinia (vTF7-3) available upon request    
pN, pP, pl plasmids available upon request    
Calcium Chloride Sigma C1016  
Magnesium Chloride Sigma M8266  
HEK 293T cells Open Biosystems HCL4517  
60 mm TC-Treated Culture Dish Corning 430166  
75 cm2 Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap Corning 430641  
Media : DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) Invitrogen 12491-015  
1 M HEPES pH 7.4 Gibo 15630-080  
FBS: Fetal Bovine Serum Gibco 10437-028  
PKS Invitrogen 15140-163  
Lipofectamine 2,000 Transfection Reagent Invitrogen 11668-019  
Syringe: 5 ml Luer-Lock syringe Sigma Z248010-1PAK  
Syringe Filters Nalgene 190-2520  
PEI: High Potency Linear PEI Polysciences 23966  
      Viral Centrifugation
Corning 150 ml Tube Top Vacuum Filter System, 0.45 μm Pore Corning 430314  
Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 ml, 25 x 89 mm ultracentrifuge tubes Beckman-Coulter 344058  
Ultracentrifuge Beckman-Coulter optima XL-80K  
SW28 Ultracentrifuge rotor Beckman-Coulter 342207  
      Mouse Injection
Capillary micropipets Drummond 5-000-2005  
Stereotax Narishige SR-5M  
Micromanipulator Narishige SM-15  
Ump injector World Precision Instruments Sys-Micro4  
Four channel microcontroller World Precision Instruments UMP3  
M.TXB Bench Motor with C.EMX-1 Dial Control, 115 Volt Foredom M.TXB-EM  
H.10 Handpiece, Quick Change Foredom H.10  
Step Drill, 0.5 mm Foredom A-58005P  
Microelectrode holder World Precision Instruments MEH2S  
Ketamine Henry Schein 995-2949  
Xylazine Henry Schein 4015809TV  
Buprenorphine Henry Schein 1118217  
1 ml syringe Becton-Dickinson 309628  
30 gauge injection needle Becton-Dickinson 305106  
Protective Ophthalmic Ointment Doctors Foster and Smith 9N-014748  
Ethanol Sigma 493511  
Iodine Sigma PVP1  
      Surgery and Dissection tools
Scissors Fine Science Tools 91402-12  
Standard Forceps Fine Science Tools 11000-12  
Fine Forceps Fine Science Tools 11255-20  
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-00  
Scalpel handle Fine Science Tools 10003-12  
Scalpel blades Fine Science Tools 10015-00  
Sutures Robbins Instruments 20.SK640  
      Dissection and antibody staining
paraformaldehyde Sigma P6148  
Phosphate Buffered Saline Sigma P4417  
Triton X-100 Sigma T9284  
Donkey Serum Jackson Immunoresearch 017-000-121  
      Antibodies
Antibodies millipore AB144P  
Anti-gfp Abcam ab13970  
Donkey anti-chicken Dylight 488 Jackson immunoresearch 703-545-155  
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647 Jackson immunoresearch 705-605-147  
DAPI Invitrogen D1306  
      Tissue mounting
Superfrost plus microscope slides Fisher 12-550-100  
Cover glass 22 x 22, 0 thickness Electron Microscopy Sciences 72198-10  
Silicone elastomer Rogers Corp HT-6220  
Clear nail polish Electron Microscopy Sciences 72180  
Prolong Gold antifade reagent Invitrogen P36930  

References

  1. Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
  2. Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo. Neuron. 67, 562-574 (2010).
  3. Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).
  4. Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
  5. Yonehara, K. Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit. Nature. 469, 407-410 (2011).
  6. Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells. Neuron. 68, 456-472 (2010).
  7. Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells. Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).
  8. Seidler, B. A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).
  9. Beier, K. T. Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).
  10. Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).
  11. Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase. PNAS. 83, 8122-8126 (1986).
  12. Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses. J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).
  13. Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).
  14. Franklin, K., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
  15. van den Pol, A. N. Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression. J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).

Play Video

Cite This Article
Beier, K., Cepko, C. Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry. J. Vis. Exp. (68), e4253, doi:10.3791/4253 (2012).

View Video