تتبع الفيروسية من الدوائر العصبية تعريف وراثيا
Summary
ووصف طريقة تتبع الخلايا العصبية مرتبطة synaptically. نستخدم TVA خصوصية خلية المنبع لبحث ما إذا كان السكان الخلية ذات الاهتمام يتلقى مساهمات من أنواع الخلايا متشابك تعريف وراثيا.
Abstract
الطرق التقليدية لدراسة الدوائر العصبية هي الإنتاجية منخفضة نسبيا. الفيروسات عبر التشابك، وخاصة داء الكلب الكاذب (PRV) وفيروس داء الكلب (RABV)، وفيروس التهاب الفم الحويصلي مؤخرا (VSV)، لدراسة الدوائر، تزداد شعبية. هذه الأساليب أعلى إنتاجية استخدام الفيروسات التي تنقل بين الخلايا العصبية في الاتجاه إما تقدمي أو رجعي.
مؤخرا، تم وضع RABV تعديل لتتبع أحادي المشبك الوراء. (الشكل 1A). في هذه الطريقة، يتم حذف بروتين سكري (G) الجينات من الجينوم الفيروسي، والامدادات فقط في الخلايا العصبية المستهدفة. ويتحقق خصوصية العدوى عن طريق استبدال لG خيالية، ويتألف من مجال خارج الخلية من بروتين سكري ASLV A-والمجال حشوية من RABV-G (A RG /)، لG-RABV العادية 1. هذا G خيالية يصيب الخلايا على وجه التحديد التعبير عن مستقبلات TVA 1. يمكن للترميز الجين TVA كان دelivered بطرق مختلفة 2-8. بعد RABV-G إصابة الخلايا العصبيه TVA، معربا عن، يمكن أن يحيل إلى RABV الخلايا العصبية، وغيرها من توصيل synaptically في اتجاه الوراء حسب طبيعة G الخاصة الذي شارك في تسليمها مع مستقبلات TVA. تصف هذه التقنية عدد كبير نسبيا من المدخلات (5-10٪) 2 الصعود إلى نوع من الخلايا المحددة، وتوفير عينات من كل من المدخلات على نوع الخلية كاتب محدد.
ونحن مؤخرا تعديل هذه التقنية لاستخدام VSV باعتباره التتبع عبر التشابك 9. VSV ديها العديد من المزايا، بما في ذلك سرعة التعبير الجيني. نحن هنا التفاصيل جديد الفيروسية نظام تتبع باستخدام VSV مفيدة لسبر الدارات الدقيقة للقرار زيادة. في حين أن الاستراتيجيات التي نشرتها الأصلي يكرشام وآخرون (4) وبيير وآخرون .. 9 وضع العلامات تصريح من أي الخلايا العصبية التي يصاب المشروع على TVA-في البداية، معربا عن خلايا، وهنا تم تصميم VSV أن يحيل فقط إلى TVA-معربا عن الخلايا (1B الشكل). وpseudotyped الفيروس لاول مرة مع RABV-G للسماح إصابة الخلايا العصبية المصب من TVA، معربا عن الخلايا العصبية. بعد اصابة هذه الفئة من السكان الأولى من الخلايا، الذي صدر الفيروس يمكن أن تصيب فقط TVA، معربا عن الخلايا. لأنه يقتصر انتشار عبر التشابك الفيروسية لTVA، معربا عن الخلايا، ووجود عدم وجود اتصال من أنواع الخلايا المحددة يتم استكشافها مع ارتفاع القرار. يظهر مخطط تدفق تجريبية لهذه التجارب في الشكل 2. هنا نعرض نموذج الدائرة، وذلك من الانتقائية الاتجاه في شبكية العين الماوس. ندرس التواصل بين الخلايا عديم الاستطالات النجمي (الحويصلات) إلى خلايا الشبكية العقدة (RGCs).
Protocol
Discussion
باستخدام الفيروسات لدراسة الدوائر العصبية هي طريقة إنتاجية عالية نسبيا من الخلايا العصبية تحليل المتصلة. ومع ذلك، على حد سواء توليد VSV وvirions RABV ليست تافهة. على الرغم من أن يتم توفير بروتوكول المذكورة أعلاه لإنقاذ الفيروس من [كدنا]، فإنه لا يزال حدثا المنخفضة الاحتمال….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعترف شون ويلان للحصول على مساعدة إنقاذ المتغيرات VSV المؤتلف، وديدم بيدا وChrenek ريان للمساعدة التقنية. وأيد هذا العمل من قبل HHMI (CLC)، و# NS068012-01 (KTB).
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | |
| Tissue Culture | |||
| Baby Hamster Kidney (BSRT7) cells | available upon request | ||
| vaccinia (vTF7-3) | available upon request | ||
| pN, pP, pl plasmids | available upon request | ||
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEK 293T cells | Open Biosystems | HCL4517 | |
| 60 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430166 | |
| 75 cm2 Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 430641 | |
| Media : DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Invitrogen | 12491-015 | |
| 1 M HEPES pH 7.4 | Gibo | 15630-080 | |
| FBS: Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| PKS | Invitrogen | 15140-163 | |
| Lipofectamine 2,000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Syringe: 5 ml Luer-Lock syringe | Sigma | Z248010-1PAK | |
| Syringe Filters | Nalgene | 190-2520 | |
| PEI: High Potency Linear PEI | Polysciences | 23966 | |
| Viral Centrifugation | |||
| Corning 150 ml Tube Top Vacuum Filter System, 0.45 μm Pore | Corning | 430314 | |
| Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 ml, 25 x 89 mm ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344058 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | optima XL-80K | |
| SW28 Ultracentrifuge rotor | Beckman-Coulter | 342207 | |
| Mouse Injection | |||
| Capillary micropipets | Drummond | 5-000-2005 | |
| Stereotax | Narishige | SR-5M | |
| Micromanipulator | Narishige | SM-15 | |
| Ump injector | World Precision Instruments | Sys-Micro4 | |
| Four channel microcontroller | World Precision Instruments | UMP3 | |
| M.TXB Bench Motor with C.EMX-1 Dial Control, 115 Volt | Foredom | M.TXB-EM | |
| H.10 Handpiece, Quick Change | Foredom | H.10 | |
| Step Drill, 0.5 mm | Foredom | A-58005P | |
| Microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH2S | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | |
| Buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | |
| 1 ml syringe | Becton-Dickinson | 309628 | |
| 30 gauge injection needle | Becton-Dickinson | 305106 | |
| Protective Ophthalmic Ointment | Doctors Foster and Smith | 9N-014748 | |
| Ethanol | Sigma | 493511 | |
| Iodine | Sigma | PVP1 | |
| Surgery and Dissection tools | |||
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sutures | Robbins Instruments | 20.SK640 | |
| Dissection and antibody staining | |||
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Antibodies | |||
| Antibodies | millipore | AB144P | |
| Anti-gfp | Abcam | ab13970 | |
| Donkey anti-chicken Dylight 488 | Jackson immunoresearch | 703-545-155 | |
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647 | Jackson immunoresearch | 705-605-147 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Tissue mounting | |||
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-100 | |
| Cover glass 22 x 22, 0 thickness | Electron Microscopy Sciences | 72198-10 | |
| Silicone elastomer | Rogers Corp | HT-6220 | |
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 |
References
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo. Neuron. 67, 562-574 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Yonehara, K. Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit. Nature. 469, 407-410 (2011).
- Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells. Neuron. 68, 456-472 (2010).
- Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells. Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).
- Seidler, B. A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).
- Beier, K. T. Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).
- Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).
- Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase. PNAS. 83, 8122-8126 (1986).
- Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses. J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).
- Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).
- Franklin, K., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
- van den Pol, A. N. Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression. J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).
