Trazado de Circuitos Viral genéticamente definidos Neural
Summary
Un método de rastreo de neuronas conectadas sinápticamente se describe. Usamos especificidad TVA de una célula de aguas arriba para probar si una población celular de interés recibe la entrada sináptica de tipos de células genéticamente definidos.
Abstract
Los métodos clásicos para el estudio de los circuitos neuronales están rendimiento bastante bajo. Transsynaptic virus, particularmente la pseudorrabia (PRV) y virus de la rabia (RABV), y más recientemente virus de la estomatitis vesicular (VSV), para el estudio de circuitos, es cada vez más popular. Estos métodos de rendimiento más altos utilizan virus que transmiten entre las neuronas, ya sea en la dirección anterógrada o retrógrada.
Recientemente, un RABV modificado para monosináptico retrógrada rastreo fue desarrollado. (Figura 1A). En este método, la glicoproteína (G) de genes se elimina del genoma viral, y reabastecidos sólo en las neuronas específicas. Especificidad infección se logra mediante la sustitución de una G quimérico, formado por el dominio extracelular de la glicoproteína ASLV-A y el dominio citoplásmico de la RABV-G (A / RG), para el normal RABV-G 1. Este G quimérica específicamente infecta las células que expresan el receptor TVA 1. El gen que codifica TVA puede sido delivered por diversos métodos 2-8. Tras RABV-G infección de una neurona TVA-expresando, el RABV puede transmitir a otras neuronas, conectadas sinápticamente en una dirección retrógrada por la naturaleza de su propio G que fue cosuministrado con el receptor de TVA. Esta técnica etiqueta un número relativamente grande de entradas (5-10%) 2 en un tipo celular definido, proporcionando un muestreo de todas las entradas en un tipo de célula de arranque definido.
Recientemente hemos modificado esta técnica a utilizar VSV como un trazador transsynaptic 9. VSV tiene varias ventajas, incluyendo la rapidez de la expresión génica. A continuación detallamos un nuevo sistema de rastreo viral utilizando útiles para sondear microcircuitos con mayor resolución VSV. Mientras que las estrategias original publicado por Wickersham et al. 4 y Beier et al. 9 permiso de etiquetado de cualquier neuronas que se proyectan hacia inicialmente infectado-TVA-expresando células, aquí VSV fue diseñado para transmitir sólo a TVCélulas que expresan A-(Figura 1B). El virus es primero pseudotyped con RABV-G para permitir la infección de aguas abajo de las neuronas que expresan TVA neuronas. Después de infectar esta primera población de células, el virus liberado sólo pueden infectar células que expresan TVA. Debido a la propagación viral transsynaptic se limita a las células que expresan TVA, la presencia de ausencia de la conectividad de los tipos de células definidos pueden ser explorados con alta resolución. Un diagrama de flujo experimental de estos experimentos se muestra en la Figura 2. Aquí se muestra un circuito de modelo, el de la dirección de selectividad en la retina del ratón. Se examina la conectividad de las células amacrinas starburst (ZEC) a las células ganglionares de la retina (CGR).
Protocol
Discussion
Uso de virus para estudiar circuitos neuronales es un método de rendimiento relativamente alto de analizar neuronas conectadas. Sin embargo, generar tanto VSV y viriones RABV no es trivial. Aunque el protocolo enumerados anteriormente para el virus de rescate a partir de ADNc se proporciona, todavía es un evento de baja probabilidad. Los niveles de cada uno de los N, P, L y plásmidos necesitan ser ajustado con precisión, ya que muchos ensayos y replica necesita hacer para asegurar rescate viral. La formación de la …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría reconocer Sean Whelan para obtener ayuda con el rescate de las variantes recombinantes VSV y Didem Goz y Chrenek Ryan de asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por el HHMI (CLC), y # NS068012-01 (KTB).
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | |
| Tissue Culture | |||
| Baby Hamster Kidney (BSRT7) cells | available upon request | ||
| vaccinia (vTF7-3) | available upon request | ||
| pN, pP, pl plasmids | available upon request | ||
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEK 293T cells | Open Biosystems | HCL4517 | |
| 60 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430166 | |
| 75 cm2 Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 430641 | |
| Media : DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Invitrogen | 12491-015 | |
| 1 M HEPES pH 7.4 | Gibo | 15630-080 | |
| FBS: Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| PKS | Invitrogen | 15140-163 | |
| Lipofectamine 2,000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Syringe: 5 ml Luer-Lock syringe | Sigma | Z248010-1PAK | |
| Syringe Filters | Nalgene | 190-2520 | |
| PEI: High Potency Linear PEI | Polysciences | 23966 | |
| Viral Centrifugation | |||
| Corning 150 ml Tube Top Vacuum Filter System, 0.45 μm Pore | Corning | 430314 | |
| Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 ml, 25 x 89 mm ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344058 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | optima XL-80K | |
| SW28 Ultracentrifuge rotor | Beckman-Coulter | 342207 | |
| Mouse Injection | |||
| Capillary micropipets | Drummond | 5-000-2005 | |
| Stereotax | Narishige | SR-5M | |
| Micromanipulator | Narishige | SM-15 | |
| Ump injector | World Precision Instruments | Sys-Micro4 | |
| Four channel microcontroller | World Precision Instruments | UMP3 | |
| M.TXB Bench Motor with C.EMX-1 Dial Control, 115 Volt | Foredom | M.TXB-EM | |
| H.10 Handpiece, Quick Change | Foredom | H.10 | |
| Step Drill, 0.5 mm | Foredom | A-58005P | |
| Microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH2S | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | |
| Buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | |
| 1 ml syringe | Becton-Dickinson | 309628 | |
| 30 gauge injection needle | Becton-Dickinson | 305106 | |
| Protective Ophthalmic Ointment | Doctors Foster and Smith | 9N-014748 | |
| Ethanol | Sigma | 493511 | |
| Iodine | Sigma | PVP1 | |
| Surgery and Dissection tools | |||
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sutures | Robbins Instruments | 20.SK640 | |
| Dissection and antibody staining | |||
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Antibodies | |||
| Antibodies | millipore | AB144P | |
| Anti-gfp | Abcam | ab13970 | |
| Donkey anti-chicken Dylight 488 | Jackson immunoresearch | 703-545-155 | |
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647 | Jackson immunoresearch | 705-605-147 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Tissue mounting | |||
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-100 | |
| Cover glass 22 x 22, 0 thickness | Electron Microscopy Sciences | 72198-10 | |
| Silicone elastomer | Rogers Corp | HT-6220 | |
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 |
References
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo. Neuron. 67, 562-574 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Yonehara, K. Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit. Nature. 469, 407-410 (2011).
- Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells. Neuron. 68, 456-472 (2010).
- Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells. Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).
- Seidler, B. A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).
- Beier, K. T. Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).
- Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).
- Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase. PNAS. 83, 8122-8126 (1986).
- Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses. J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).
- Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).
- Franklin, K., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
- van den Pol, A. N. Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression. J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).
