Quantifier glomérulaire perméabilité des macromolécules fluorescentes en microscopie 2 photons à Munich chez le rat Wistar

Summary

Une technique utilisant haute résolution intavital microscopie 2-photons pour visualiser directement et de quantifier filtration gloemrular dans les glomérules de surface. Cette méthode permet la détermination directe des caractéristiques de perméabilité des macromolécules dans des états normaux et malades.

Abstract

Les maladies du rein impliquant la perte urinaire de grandes macromolécules essentielles, comme l'albumine sérique, ont longtemps été pensé pour être causés par des altérations de la barrière de perméabilité composé de podocytes, cellules endothéliales vasculaires, et une membrane basale de travail à l'unisson. Les données de notre laboratoire en utilisant intravitale microscopie 2 photons ont révélé une barrière plus perméable de filtration glomérulaire (GFB) qu'on ne le pensait dans des conditions physiologiques, avec récupération des filtré albumine se produisant dans un sous-ensemble au début de cellules appelées cellules des tubules proximaux (PTC) ^{1,2 3.}

Les techniques précédentes utilisées pour étudier la filtration rénale et d'établir les caractéristiques de la barrière de filtration impliqué micropuncture de la lumière de ces segments tubulaires début de l'échantillonnage du contenu et analyse ⁴ fluide. Ces études ont déterminé la concentration d'albumine dans le liquide luminal être pratiquement inexistante; correspondant étroitementpour ce qui est normalement détecté dans l'urine. Cependant, la caractérisation des polymères de dextran avec des tailles définies par cette technique a révélé celles d'une taille similaire à l'albumine sérique des niveaux plus élevés dans la lumière tubulaire et l'urine; suggérant une perméabilité accrue ^5.

Ce document est un aperçu détaillé de la technique utilisée pour visualiser et quantifier directement glomérulaire fluorescent perméabilité albumine in vivo. Cette méthode permet la détection de l'albumine filtrée à travers la barrière de filtration dans l'espace de Bowman (la chambre initiale de filtration urinaire), et permet également la quantification de l'albumine réabsorption par les tubules proximaux et la visualisation de suite transcytosis albumine ^6. L'absence d'albumine fluorescent le long des segments tubulaires plus tard, en route vers la vessie met en évidence l'efficacité de la voie de récupération dans les segments des tubules proximaux plus tôt. De plus, lorsque cette technique a été appliquée pour déterminer la perméabilitéde dextranes ayant une taille similaire à des valeurs de perméabilité pratiquement identiques albumine ont été signalés ^2. Ces observations appuient directement la nécessité d'élargir la portée de beaucoup de maladies rénales protéinuriques de modifications incluses dans la remise en état des cellules du tubule proximal.

Protocol

1. Conjugaison de sérum albumine de rat de sulfo-rhodamine 101 sulfonyle (Texas Red) Dissoudre 100 mg de Rat albumine sérique (RSA) dans 6.667 ml de 100 mM Sodium Bicarbonate pH 9,0; concentration finale de 15 mg / ml dans un tube conique de 50 ml. Lieu solution dans la glace / eau bécher et refroidir à entre 0 et 4 ° C. Ajouter 200 pi de qualité diméthylformamide élevé (DMF) anhydre à un flacon de 10 mg de Texas Red sulfonyle (TRSC); vortex sur le milieu pendant 15 sec. <li…

Representative Results

La figure 3 montre un exemple d'une image prise à partir d'un glomérule de surface d'un Munich Wistar Frömter rat et les mesures prises pour déterminer la perméabilité de l'albumine fluorescente. La valeur CGC de l'albumine de 0,0111 dérivé pour cette glomérule chute individu au sein de la gamme vu dans cette souche de rats Wistar Munich lorsque dans l'état nourri 3. La stabilité observée dans ces images est due à la planification minutieuse et l'exéc…

Discussion

Les étapes soulignés ici représentent ce que nous croyons être celles qui vont produire des valeurs de perméabilité cohérentes et précises car elles contournent les pièges suivants:

1. Diffusion: L'utilisation d'un dispositif d'émission des fluorophores rouges permettre une collecte plus efficace de la lumière depuis plus photons de longueurs d'onde sont moins enclins à se disperser. En utilisant soit des fluorophores émettant vert ou bleu va introduire une plus grande variation da…

Materials

Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope	Olympus America		Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors	Hamamatsu Corp		Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software	Molecular Dynamics		Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 version
Handling Forceps	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad	Gaymar		T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater	ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride	Invitrogen/Molecular Probes	Cat# T-353
Rat Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 70665-07