Quantifizierung glomeruläre Permeabilität von fluoreszierenden Makromoleküle Verwendung von 2-Photonen-Mikroskopie in München Wistar Ratten

Summary

Eine Technik, die Verwendung hochauflösende intavital 2-Photonen-Mikroskopie direkt visualisieren und quantifizieren gloemrular Filtration in Oberfläche Glomeruli. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Bestimmung der Durchlässigkeit Eigenschaften von Makromolekülen in normalen und erkrankten Staaten.

Abstract

Nierenerkrankungen mit Urin Verlust großer wesentlichen Makromoleküle, wie zB Serumalbumin, sind seit langem vermutlich durch Veränderungen in der Permeabilitätsbarriere podocytes umfasst, vaskuläre Endothelzellen und einer Basalmembran zusammen arbeiten verursacht werden. Daten aus unserem Labor mittels intravitaler 2-Photonen-Mikroskopie zeigte eine durchlässiger glomerulären Filtrationsrate Barriere (GFB) als bisher unter physiologischen Bedingungen haben, mit Abruf von gefilterten Albumin vorkommende in einem frühen Untergruppe von Zellen, die sogenannten proximalen Tubuluszellen (PTC) ^{1,2, 3.}

Zurück Techniken verwendet, um Nierenfiltration studieren und zur Gründung der Charakteristik der Filtration Barriere beteiligt micropuncture des Lumen dieser frühen Rohrsegmente mit der Probenahme und Analyse Fluidgehalt ^4. Diese Studien bestimmt Albumin-Konzentration in der luminalen Flüssigkeit praktisch nicht existent; entsprechend engzu dem, was in der Regel im Urin nachgewiesen. Allerdings ergab die Charakterisierung von Dextran Polymere mit definierter Größe durch diese Technik die von ähnlicher Größe wie Serumalbumin hatte höheren Ebenen in der röhrenförmigen Lumen und Urin, was darauf hindeutet, erhöhte Durchlässigkeit ^5.

Hier ist eine detaillierte Beschreibung der Technik verwendet, um direkt zu visualisieren und quantifizieren glomerulären fluoreszierenden Albumindurchlässigkeit in vivo. Dieses Verfahren ermöglicht die Erkennung von gefilterten Albumin über den Filtrationsbarriere in Bowman-Raum (die erste Kammer des Urin-Filtration) und erlaubt auch die Quantifizierung von Albumin Reabsorption von proximalen Tubuli und Visualisierung der nachfolgenden Albumin Transzytose ^6. Das Fehlen von fluoreszierenden Albumin entlang später Rohrsegmente auf dem Weg zu der Blase wie die Effizienz des Abrufs Weg in den früheren proximalen Tubulus-Segmente. Darüber hinaus, um, wenn diese Technik angewendet wurde, bestimmen Permeabilitätvon Dextranen mit einer ähnlichen Größe wie Albumin praktisch identisch Permeabilitäten wurden ^{2 angegeben.} Diese Beobachtungen unterstützen direkt die Notwendigkeit, den Fokus vieler Nierenerkrankungen mit Proteinurie Krankheiten enthalten Änderungen in proximalen Tubulus Zelle Rückgewinnung erweitern.

Protocol

Ein. Konjugation von Rattenserumalbumin zu Sulfo-Rhodamin 101 Sulfonsäurechlorid (Texas Red) Man löst 100 mg Rattenserumalbumin (RSA) in 6.667 ml von 100 mM Natriumhydrogencarbonat pH 9,0; Endkonzentration 15 mg / ml in einem 50 ml konischen Röhrchen. Platz Lösung in Eis / Wasser Becherglas und kühl, zwischen 0 bis 4 ° C. In 200 ul hochwertigen wasserfreien Dimethylformamid (DMF) zu einer 10 mg-Ampulle von Texas Red Sulfonsäurechlorid (TRSC); Vortex auf Medium für 15 sek. …

Representative Results

Abbildung 3 zeigt ein Beispiel eines Bildes von einer Oberfläche eines Glomerulus München Wistar Frömter Ratte und welche Schritte unternommen wurden, um die Durchlässigkeit von fluoreszierenden Albumin bestimmen gemacht. Der GSC Wert für Albumin von 0,0111 für diese einzelnen Glomerulus fallen in den Bereich in dieser Sorte von München Wistar Ratten, wenn in der Fed Zustand 3 gesehen abgeleitet. Die Stabilität in diesen Bildern zu sehen ist auf die sorgfältige Planung und Ausführun…

Discussion

Die Schritte hervorgehoben hier darstellen, was wir diejenigen, die eine konsistente und genaue Durchlässigkeit Werte erzeugen wird, weil sie die folgenden Fallstricke zu umgehen fühlen:

1. Streuung: Die Verwendung eines roten emittierende Fluorophore ermöglichen eine effizientere Sammlung von Leichtverpackungen seit längerer Wellenlänge Photonen weniger anfällig zu streuen sind. Mit entweder grün oder blau emittierende Fluorophore einführen größere Variation in der GSC wegen der erhöhten Variabilit…

Materials

Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope	Olympus America		Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors	Hamamatsu Corp		Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software	Molecular Dynamics		Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 version
Handling Forceps	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad	Gaymar		T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater	ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride	Invitrogen/Molecular Probes	Cat# T-353
Rat Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 70665-07