Количественная клубочковой проницаемости Флуоресцентные макромолекул Используя 2-фотонной микроскопии в Мюнхене крыс Wistar

Summary

Техника использования высокого разрешения intavital 2-фотонной микроскопии непосредственно визуализировать и количественно gloemrular поверхность фильтрации в клубочках. Этот метод позволяет прямое определение характеристик проницаемости макромолекул в нормальных и болезненные состояния.

Abstract

Почки заболеваниях, сопровождающихся потерей мочи необходимы большие макромолекулы, такие как сывороточный альбумин, долгое время считалось, вызваны изменениями в проницаемости барьера состоит из подоциты, сосудистых эндотелиальных клеток и базальной мембраны, работающих в унисон. Данные из нашей лаборатории с использованием прижизненной 2-фотонной микроскопии показало барьер более проницаемым клубочковой фильтрации (GFB), чем считалось ранее в физиологических условиях, с поиска фильтруются альбумина, происходящих в раннем подмножество клеток, называемых клетками проксимальных канальцев (PTC) ^{1,2, 3.}

Предыдущие методы, используемые для изучения почечной фильтрации и создание характеристику фильтрации барьера, связанного микропункции просвета этих первых трубчатых сегментов с отбором проб флюида содержание и анализ ^4. Эти исследования определяется концентрация альбумина в просвете жидкостью практически не существует; соответствующие теснона то, что обычно обнаруживаются в моче. Тем не менее, характеристики полимеров декстрана с определенными размерами по этой методике показали те, размеры которого аналогичны для сывороточного альбумина имели более высокие уровни в просвете канальцев и мочи; предлагая повышенную проницаемость ^5.

Здесь, представляет собой подробное описание техники, используемой непосредственно визуализировать и количественно клубочковой проницаемости люминесцентные альбумина в естественных условиях. Этот метод позволяет обнаруживать фильтрованной альбумина через фильтрационный барьер в пространство Боумена (начальное камеры мочевого фильтрации), а также позволяет количественно альбумина реабсорбции проксимальных канальцев и визуализации последующего альбумин трансцитоза ^6. Отсутствие флуоресцентный белок по позже трубчатых сегментов пути в мочевой пузырь подчеркивает эффективность поиска пути в ранее проксимальных сегментах канальцев. Кроме того, когда эта методика была применена для определения проницаемостидекстранов имеющие такого же размера, альбумина практически одинаковые значения проницаемости были зарегистрированы ^2. Эти наблюдения непосредственно поддерживают необходимость расширения в центре внимания многих протеинурической почечных заболеваний включены изменения в проксимальных канальцах клетки мелиорации.

Protocol

1. Сопряжение Крысы сывороточный альбумин сульфо-родамина 101 сульфонилхлорид (Texas Red) Растворяют 100 мг крысы сывороточного альбумина (RSA) в 6,667 мл 100 мМ бикарбонат натрия рН 9,0; конечной концентрации 15 мг / мл в 50 мл коническую трубку. Место решения в лед / вода стакан и охлаждают до …

Representative Results

На рисунке 3 показан пример изображения, снятого с поверхности клубочка из Мюнхена крысы линии Вистар Frömter и шаги, предпринятые для определения проницаемости флуоресцентных альбумина. GSC значение для альбумина 0,0111 полученные для этого отдельные клубочки падения в диапазоне в…

Discussion

Шаги отраженных здесь представляют, что мы чувствуем, что те, которые будут производить последовательные и точные значения проницаемости, потому что они обойти ловушки следующие:

1. Рассеяния: использование красного флуорофорам излучающих обеспечить более эффективный сбор света…

Materials

Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope	Olympus America		Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors	Hamamatsu Corp		Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software	Molecular Dynamics		Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 version
Handling Forceps	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad	Gaymar		T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater	ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride	Invitrogen/Molecular Probes	Cat# T-353
Rat Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 70665-07